GB 5009.33—2010 分光光度法
1、原理
亞硝酸鹽採用鹽酸萘乙二胺法測定測定。
試樣經沉澱蛋白質、除去脂肪後，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化後，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標法測得亞硝酸鹽含量。
2、試劑和材料
除非另有規定，本方法所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682 規定的二級水或去離子水。
2.1 亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O）
2.2 乙酸鋅（Zn(CH3COO)2·2H2O）
2.3 冰醋酸（CH3COOH）
2.4 硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）
2.5 對氨基苯磺酸(C6H7NO3S）
2.6鹽酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）
2.7亞硝酸鈉（NaNO2）
2.8硝酸鈉（NaNO3）
2.9鋅皮或鋅棒。
2.10硫酸鎘。
2.11亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)：
稱取106.0 g 亞鐵氰化鉀（2.1），用水溶解，並稀釋至1000 mL。
2.12乙酸鋅溶液(220 g/L)：稱取220.0 g乙酸鋅（2.2），先加30 mL 冰醋酸（2.3）溶解，用水稀釋至1000 mL。
2.13飽和硼砂溶液(50 g/L)：稱取5.0 g硼酸鈉（2.4），溶於100 mL 熱水中，冷卻後備用。
2.14對氨基苯磺酸溶液（4 g/L） ：稱取 0.4g對氨基苯磺酸（2.5），溶於100 mL 20 %
（V/V）鹽酸中，置棕色瓶中混勻，避光儲存。
2.15鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：稱取0.2 g 鹽酸萘乙二胺（2.6），溶於100 mL 水中,
混勻後，置棕色瓶中，避光儲存。
2.16亞硝酸鈉標準溶液（200 μg /mL）：準確稱取0.1000g於110℃～120℃乾燥恆重的亞硝酸鈉，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
2.17亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標準溶液5.00 mL，置於 200 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。
2.17硝酸鈉標準溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準確稱取0.1232 g 於110 ℃～120
℃乾燥恆重的硝酸鈉，加水溶解，移於入500 mL 容量瓶中，並稀釋至刻度。
2.18硝酸鈉標準使用液（5 μg/mL）：臨用時吸取硝酸鈉標準溶液2.50 mL，置於100 mL
容量瓶中，加水稀釋至刻度。
3、儀器和裝置
3.1 天平：感量為0.1 mg 和1 mg。
3.2組織搗碎機。
3.3超聲波清洗器。
3.4恆溫乾燥箱。
3.5分光光度計。
4、測定
4.1試樣的預處理
新鮮蔬菜、水果：將試樣用去離子水洗淨，晾乾後，取可食部切碎混勻。將切碎的樣品用四分法取適量，用食物粉碎機制成勻漿備用。如需加水應記錄加水量。
4.2提取
稱取5g（精確至0.01 g）製成勻漿的試樣（如製備過程中加水，應按加水量折算），置於
50 mL燒杯中，加12.5 mL 飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以 70 ℃左右的水約300 mL 將試樣洗入500 mL容量瓶中，於沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，並放置至室溫。
4.3提取液淨化
在振盪上述提取液時加入5 mL 亞鐵氰化鉀溶液, 搖勻, 再加入5 mL 乙酸鋅溶液，以沉澱蛋白質。加水至刻度, 搖勻, 放置30 min, 除去上層脂肪, 上清液用濾紙過濾, 棄去初濾液30 mL, 濾液備用。
4.4亞硝酸鹽的測定
吸取40.0 mL 上述濾液於50 mL帶塞比色管中，另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 亞硝酸鈉標準使用液（相當於0.0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0μg、12.5 μg亞硝酸鈉），分別置於50 mL 帶塞比色管中。於標準管與試樣管中分別加入2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3 min～5 min 後各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm 比色杯，以零管調節零點，于波長538 nm處測吸光度，繪製標準曲線比較。同時做試劑空白。
5、分析結果的表述
5.1亞硝酸鹽含量計算
亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量按式（3）進行計算
式中：
X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A1——測定用樣液中亞硝酸鈉的質量，單位為微克（μg）；
m——試樣質量，單位為克（g）；
V1——測定用樣液體積，單位為毫升（mL）；
V0 ——試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）。
以重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數字。
6、精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %
GB 5009.33—2010 分光光度法
1、原理
亞硝酸鹽採用鹽酸萘乙二胺法測定測定。
試樣經沉澱蛋白質、除去脂肪後，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化後，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標法測得亞硝酸鹽含量。
2、試劑和材料
除非另有規定，本方法所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682 規定的二級水或去離子水。
2.1 亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O）
2.2 乙酸鋅（Zn(CH3COO)2·2H2O）
2.3 冰醋酸（CH3COOH）
2.4 硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）
2.5 對氨基苯磺酸(C6H7NO3S）
2.6鹽酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）
2.7亞硝酸鈉（NaNO2）
2.8硝酸鈉（NaNO3）
2.9鋅皮或鋅棒。
2.10硫酸鎘。
2.11亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)：
稱取106.0 g 亞鐵氰化鉀（2.1），用水溶解，並稀釋至1000 mL。
2.12乙酸鋅溶液(220 g/L)：稱取220.0 g乙酸鋅（2.2），先加30 mL 冰醋酸（2.3）溶解，用水稀釋至1000 mL。
2.13飽和硼砂溶液(50 g/L)：稱取5.0 g硼酸鈉（2.4），溶於100 mL 熱水中，冷卻後備用。
2.14對氨基苯磺酸溶液（4 g/L） ：稱取 0.4g對氨基苯磺酸（2.5），溶於100 mL 20 %
（V/V）鹽酸中，置棕色瓶中混勻，避光儲存。
2.15鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：稱取0.2 g 鹽酸萘乙二胺（2.6），溶於100 mL 水中,
混勻後，置棕色瓶中，避光儲存。
2.16亞硝酸鈉標準溶液（200 μg /mL）：準確稱取0.1000g於110℃～120℃乾燥恆重的亞硝酸鈉，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
2.17亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標準溶液5.00 mL，置於 200 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。
2.17硝酸鈉標準溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準確稱取0.1232 g 於110 ℃～120
℃乾燥恆重的硝酸鈉，加水溶解，移於入500 mL 容量瓶中，並稀釋至刻度。
2.18硝酸鈉標準使用液（5 μg/mL）：臨用時吸取硝酸鈉標準溶液2.50 mL，置於100 mL
容量瓶中，加水稀釋至刻度。
3、儀器和裝置
3.1 天平：感量為0.1 mg 和1 mg。
3.2組織搗碎機。
3.3超聲波清洗器。
3.4恆溫乾燥箱。
3.5分光光度計。
4、測定
4.1試樣的預處理
新鮮蔬菜、水果：將試樣用去離子水洗淨，晾乾後，取可食部切碎混勻。將切碎的樣品用四分法取適量，用食物粉碎機制成勻漿備用。如需加水應記錄加水量。
4.2提取
稱取5g（精確至0.01 g）製成勻漿的試樣（如製備過程中加水，應按加水量折算），置於
50 mL燒杯中，加12.5 mL 飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以 70 ℃左右的水約300 mL 將試樣洗入500 mL容量瓶中，於沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，並放置至室溫。
4.3提取液淨化
在振盪上述提取液時加入5 mL 亞鐵氰化鉀溶液, 搖勻, 再加入5 mL 乙酸鋅溶液，以沉澱蛋白質。加水至刻度, 搖勻, 放置30 min, 除去上層脂肪, 上清液用濾紙過濾, 棄去初濾液30 mL, 濾液備用。
4.4亞硝酸鹽的測定
吸取40.0 mL 上述濾液於50 mL帶塞比色管中，另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 亞硝酸鈉標準使用液（相當於0.0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0μg、12.5 μg亞硝酸鈉），分別置於50 mL 帶塞比色管中。於標準管與試樣管中分別加入2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3 min～5 min 後各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm 比色杯，以零管調節零點，于波長538 nm處測吸光度，繪製標準曲線比較。同時做試劑空白。
5、分析結果的表述
5.1亞硝酸鹽含量計算
亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量按式（3）進行計算
式中：
X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A1——測定用樣液中亞硝酸鈉的質量，單位為微克（μg）；
m——試樣質量，單位為克（g）；
V1——測定用樣液體積，單位為毫升（mL）；
V0 ——試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）。
以重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數字。
6、精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %