變性條件——SDS LB直接裂解： 用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利於阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質會改變）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上並煮樣。通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDSLB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣後會發現tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時候常規做法有兩種，1.再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.如果10min煮樣後，仍然吸不起來，才適當增加SDSLB，繼續煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉澱和水分層） 此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種製備方法制備的樣品有使用侷限。 非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細胞器分離等等了，其實類似） 裂解細胞請儘量冰上操作，減緩酶解作用。 俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用於抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很複雜也很貴，其實用0.5mMPMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。 此方法的優點：NaCl濃度略低於生理狀態，保證裂解細胞的方式較為溫和，便於隨後的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉澱非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的複合體，要得到純化的一些複合體的組成蛋白一般採用極端的高鹽裂解細胞。 用於核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用於破壞核膜結構；可用到1%，但此時染色體會析出，沉澱粘稠。 組織塊裂解： 組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。 當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我採用的方法是 1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。 2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，儘量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反覆多次。 3. 用上述細胞裂解液回收。 分泌型蛋白富集： 用無血清培養基培養細胞，收集上清液用於WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉澱富集。
變性條件——SDS LB直接裂解： 用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利於阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質會改變）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上並煮樣。通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDSLB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣後會發現tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時候常規做法有兩種，1.再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.如果10min煮樣後，仍然吸不起來，才適當增加SDSLB，繼續煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉澱和水分層） 此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種製備方法制備的樣品有使用侷限。 非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細胞器分離等等了，其實類似） 裂解細胞請儘量冰上操作，減緩酶解作用。 俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用於抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很複雜也很貴，其實用0.5mMPMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。 此方法的優點：NaCl濃度略低於生理狀態，保證裂解細胞的方式較為溫和，便於隨後的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉澱非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的複合體，要得到純化的一些複合體的組成蛋白一般採用極端的高鹽裂解細胞。 用於核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用於破壞核膜結構；可用到1%，但此時染色體會析出，沉澱粘稠。 組織塊裂解： 組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。 當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我採用的方法是 1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。 2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，儘量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反覆多次。 3. 用上述細胞裂解液回收。 分泌型蛋白富集： 用無血清培養基培養細胞，收集上清液用於WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉澱富集。