我們應用PCR技術，放大EHP的18SrRNA基因，再用標記地可辛的探針探測原位雜交細胞中被感染的EHP，最後開發新的PCR技術探測對蝦組織，排洩物和水中的EHP。
2.材料和方法
2.1對蝦
2006年在汶萊收集了感染對蝦腸孢子蟲（EHP）的南美蘭對蝦。2014年和2015年在越南蝦塘裡收集了感染EHP的南美白對蝦。2014年，從泰國運送了一批南美蘭對蝦到我們亞利桑那大學的實驗室進行隔離檢測，這些對蝦後來被檢測出感染了EHP，它們的肝胰腺，排洩物和水進行了PCR技術取樣檢測。
為了檢測原位雜交（ISH），並透過PCR技術分析EHP的特異性，研究人員使用了具有棉蝦病臨床症狀的斑節對蝦樣本，這些對蝦來自2005年（固定組織）和2006年（冰凍組織）的馬拉加西。還使用了感染了鱷組織變形蟲的南美白對蝦，這些蝦是在2014年收集到的。透過PCR技術分析，肝胰腺組織或者整隻對蝦被保護在95%的酒精當中或被風乾後送往我們實驗室。透過原位雜交技術，用戴維森固定法將蝦固定。
2.2.DNA提取
從感染EHP的對蝦中去除肝胰腺，（4-5只蝦）放進一個樣本中。裝運感染EHP的對蝦的蝦槽中對排洩物和水進行了取樣。利用MicrosepAdvance離心裝置（PALL公司）將蝦槽裡的水濃縮150倍，用於DNA提取。用一種高純度DNA模板製備工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA純化試劑盒（Promega）。
為了測試EHP引物的特異性，PCR擴增檢測兩種寄生蟲病中的DNA：
（1）棉蝦病，2006年從馬拉加西收集了斑節對蝦，這些蝦的肌肉變白，透過rRNA基因測序，發現它們的DNA呈陰性，因為內有類似於匹裡蟲的微孢子蟲（GenBankkp825331號）；
（2）變形蟲病，這些南美白對蝦大量死亡，透過組織學檢查，最後發現這些蝦感染了變形蟲（種類不確定）。
為了保證EHP引物沒有宿主基因組的反應，製備DNA模板：
（1）來自美國夏威夷的無特定病原（SPF）的南美白對蝦（>10樣本）、斑節對蝦（3個樣本）；
（2）來自沙烏地阿拉伯的印度對蝦（2個樣本）；
（3）在新喀里多尼亞養殖的南美蘭對蝦（2個樣本）；
（4）來自菲律賓的羅氏沼蝦（2個樣本）；
（5）沙烏地阿拉伯附近蝦塘裡採集的蟹（7個樣本，未知的物種）；
（6）多毛類（3個樣本），滷蟲生物量（9個樣本），魷魚（2個樣本），磷蝦（2個樣本），這些是從各種商業供應商運送。
2.3.18S rRNA基因擴增和克隆
PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。擴增18SrRNA基因的引物18S-F（5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5’-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反應中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM Tris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化鉀，1.5毫米氯化鎂，2.5U Taq DNA聚合酶和1微升提取的DNA（10納克至100納克每微升）。放大進行下列迴圈引數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，55°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行1分鐘，做35個此迴圈週期，並在最後一個週期停留在72°C溫度下5分鐘。在一個含有溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分析PCR產物。在?1KB一帶切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy載體（Promega）上，命名為克隆pEHP-1。透過DNA測序，克隆的插入為1146bp（GenBankNo.kp759285）。國家生物技術資訊中心（NCBI）使用BLAST序列資料庫對GenBank的相似序列進行了搜尋。
2.4、探針標記和原位雜交
克隆pEHP-1質粒DNA被用來做成原位雜交時的一個探針。Mari等人描述，在PCR反應中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）標記的基因探針（1998）。用於標記反應的引物EHP-F（5’-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5’-TGCCTTGATGAGACACTGTT）產生一個1.1 kb的片段。digoxigenin標記的DNA探針，用乙醇沉澱，懸浮在水中，並存儲在-20°C。棉蝦病，感染了類似於匹裡蟲的微孢子蟲的探針如微孢子蟲，是從一個克隆的16SRNA基因區域產生。
戴維森的AFA固定蝦進行了處理，石蠟包埋，按照標準方法切片（4微米厚）（萊特納，1996）。經過脫蠟，水化，蛋白酶K消化，和後固定，切片浸泡在用500微升的雜交液中（4×SSC，50%甲醯胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鮭魚精DNA），這種雜交液中含有EHP探針含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加熱表面上10min，然後在42°C溫度下進行一夜的雜交。最終採用硝基藍四氮唑，5-溴-4-磷酸進行檢測抗地高辛抗體共軛鹼性磷酸酶（羅氏）。
2.5.EHP的PCR檢測。
PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。探測EHP的引物是EHP-510F(5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大進行下列迴圈引數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，60°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行30秒，做35個此迴圈週期，並在最後一個週期停留在72°C溫度下5分鐘。
3.1臨床症狀與EHP感染史
目前，養殖對蝦過程中所發生的EHP感染還沒有特定的的臨床症狀。EHP感染通常與發育不良和死亡率上升有關。根據越南境內的魚塘資料（蝦農個人提供的資料）：把感染後的蝦苗放入蝦塘後的前25天時間內，對蝦生長速度正常，之後，對蝦的健康狀況開始惡化；受感染的對蝦飼料進食量減少（50-70%），肝胰臟變色。對蝦受到感染之後，其體型（即重量，每週進行一次稱重）僅為健康對蝦的10-40%。對蝦EHP感染死亡率並非一成不變，根據養殖場統計，對蝦每天的死亡率約為1?2%。在實驗室測定過程中，對蝦EHP死亡率並無顯著上升，（Tangprasittipap，2013），由於測定持續週期較短（7天），有可能無法檢測出死亡率的大幅變化。情況較為嚴重的EHP感染可能會增加其他細菌感染的易感性。我們發現，在某些情況下，EHP通常伴有弧菌機會性感染（也稱為感染性肝胰腺壞死），這可能會導致增加對蝦死亡率。
我們應用PCR技術，放大EHP的18SrRNA基因，再用標記地可辛的探針探測原位雜交細胞中被感染的EHP，最後開發新的PCR技術探測對蝦組織，排洩物和水中的EHP。
2.材料和方法
2.1對蝦
2006年在汶萊收集了感染對蝦腸孢子蟲（EHP）的南美蘭對蝦。2014年和2015年在越南蝦塘裡收集了感染EHP的南美白對蝦。2014年，從泰國運送了一批南美蘭對蝦到我們亞利桑那大學的實驗室進行隔離檢測，這些對蝦後來被檢測出感染了EHP，它們的肝胰腺，排洩物和水進行了PCR技術取樣檢測。
為了檢測原位雜交（ISH），並透過PCR技術分析EHP的特異性，研究人員使用了具有棉蝦病臨床症狀的斑節對蝦樣本，這些對蝦來自2005年（固定組織）和2006年（冰凍組織）的馬拉加西。還使用了感染了鱷組織變形蟲的南美白對蝦，這些蝦是在2014年收集到的。透過PCR技術分析，肝胰腺組織或者整隻對蝦被保護在95%的酒精當中或被風乾後送往我們實驗室。透過原位雜交技術，用戴維森固定法將蝦固定。
2.2.DNA提取
從感染EHP的對蝦中去除肝胰腺，（4-5只蝦）放進一個樣本中。裝運感染EHP的對蝦的蝦槽中對排洩物和水進行了取樣。利用MicrosepAdvance離心裝置（PALL公司）將蝦槽裡的水濃縮150倍，用於DNA提取。用一種高純度DNA模板製備工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA純化試劑盒（Promega）。
為了測試EHP引物的特異性，PCR擴增檢測兩種寄生蟲病中的DNA：
（1）棉蝦病，2006年從馬拉加西收集了斑節對蝦，這些蝦的肌肉變白，透過rRNA基因測序，發現它們的DNA呈陰性，因為內有類似於匹裡蟲的微孢子蟲（GenBankkp825331號）；
（2）變形蟲病，這些南美白對蝦大量死亡，透過組織學檢查，最後發現這些蝦感染了變形蟲（種類不確定）。
為了保證EHP引物沒有宿主基因組的反應，製備DNA模板：
（1）來自美國夏威夷的無特定病原（SPF）的南美白對蝦（>10樣本）、斑節對蝦（3個樣本）；
（2）來自沙烏地阿拉伯的印度對蝦（2個樣本）；
（3）在新喀里多尼亞養殖的南美蘭對蝦（2個樣本）；
（4）來自菲律賓的羅氏沼蝦（2個樣本）；
（5）沙烏地阿拉伯附近蝦塘裡採集的蟹（7個樣本，未知的物種）；
（6）多毛類（3個樣本），滷蟲生物量（9個樣本），魷魚（2個樣本），磷蝦（2個樣本），這些是從各種商業供應商運送。
2.3.18S rRNA基因擴增和克隆
PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。擴增18SrRNA基因的引物18S-F（5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5’-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反應中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM Tris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化鉀，1.5毫米氯化鎂，2.5U Taq DNA聚合酶和1微升提取的DNA（10納克至100納克每微升）。放大進行下列迴圈引數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，55°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行1分鐘，做35個此迴圈週期，並在最後一個週期停留在72°C溫度下5分鐘。在一個含有溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分析PCR產物。在?1KB一帶切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy載體（Promega）上，命名為克隆pEHP-1。透過DNA測序，克隆的插入為1146bp（GenBankNo.kp759285）。國家生物技術資訊中心（NCBI）使用BLAST序列資料庫對GenBank的相似序列進行了搜尋。
2.4、探針標記和原位雜交
克隆pEHP-1質粒DNA被用來做成原位雜交時的一個探針。Mari等人描述，在PCR反應中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）標記的基因探針（1998）。用於標記反應的引物EHP-F（5’-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5’-TGCCTTGATGAGACACTGTT）產生一個1.1 kb的片段。digoxigenin標記的DNA探針，用乙醇沉澱，懸浮在水中，並存儲在-20°C。棉蝦病，感染了類似於匹裡蟲的微孢子蟲的探針如微孢子蟲，是從一個克隆的16SRNA基因區域產生。
戴維森的AFA固定蝦進行了處理，石蠟包埋，按照標準方法切片（4微米厚）（萊特納，1996）。經過脫蠟，水化，蛋白酶K消化，和後固定，切片浸泡在用500微升的雜交液中（4×SSC，50%甲醯胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鮭魚精DNA），這種雜交液中含有EHP探針含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加熱表面上10min，然後在42°C溫度下進行一夜的雜交。最終採用硝基藍四氮唑，5-溴-4-磷酸進行檢測抗地高辛抗體共軛鹼性磷酸酶（羅氏）。
2.5.EHP的PCR檢測。
PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。探測EHP的引物是EHP-510F(5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大進行下列迴圈引數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，60°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行30秒，做35個此迴圈週期，並在最後一個週期停留在72°C溫度下5分鐘。
3.1臨床症狀與EHP感染史
目前，養殖對蝦過程中所發生的EHP感染還沒有特定的的臨床症狀。EHP感染通常與發育不良和死亡率上升有關。根據越南境內的魚塘資料（蝦農個人提供的資料）：把感染後的蝦苗放入蝦塘後的前25天時間內，對蝦生長速度正常，之後，對蝦的健康狀況開始惡化；受感染的對蝦飼料進食量減少（50-70%），肝胰臟變色。對蝦受到感染之後，其體型（即重量，每週進行一次稱重）僅為健康對蝦的10-40%。對蝦EHP感染死亡率並非一成不變，根據養殖場統計，對蝦每天的死亡率約為1?2%。在實驗室測定過程中，對蝦EHP死亡率並無顯著上升，（Tangprasittipap，2013），由於測定持續週期較短（7天），有可能無法檢測出死亡率的大幅變化。情況較為嚴重的EHP感染可能會增加其他細菌感染的易感性。我們發現，在某些情況下，EHP通常伴有弧菌機會性感染（也稱為感染性肝胰腺壞死），這可能會導致增加對蝦死亡率。