EOS 5D Mark III搭載了新開發的61點高密度網狀陣列自動對焦感應器，能夠更加精確地捕捉被攝體。透過改良自動對焦感應器的畫素構造，低亮度下的可對焦界限達到-2EV（比過去高1級），可強效應對夜間與昏暗場景下的拍攝。61個自動對焦點中有41點採用呈十字型配置的自動對焦感應器，而且61點全部採用雙線錯置方式。即使對於僅由水平線和垂直線構成的被攝體，對焦誤差也很小，能夠穩定地進行自動對焦拍攝。EOS 5D Mark III採用的人工智慧伺服自動對焦III代的演算法與具備高捕捉能力的EOS-1D X相同。因為對動態被攝體的預測精度和追蹤能力大幅提高，運動被攝體的速度、方向急劇變化時或多個被攝體交錯的場景下，也能夠連續捕捉主被攝體，能夠輕鬆完成具有動感的人像和體育攝影。為了能針對不同場景完成適合的拍攝，EOS 5D Mark III搭載了多樣化的自動對焦區域選擇模式，各模式下的61個自動對焦點或單點或多點聯動，準確地捕捉被攝體。自動對焦區域選擇模式包括61點自動對焦、單點自動對焦、定點自動對焦、擴充套件自動對焦區域（上下左右4點）、擴充套件自動對焦區域（周圍）、區域自動對焦6種。擴充套件自動對焦區域模式有兩種，可以根據被攝體的動作和性質選擇。擴充套件自動對焦區域：上下左右4點單點自動對焦是從61個自動對焦點中任選1點進行自動對焦，能夠切實捕捉被攝體。定點自動對焦比起單點自動對焦，能在更狹小的範圍內對想要合焦的位置進行精密對焦。在進行人像攝影時想要對眼睛的瞳孔部分進行對焦，或是想要對複雜圖形連續出現的被攝體的細微部分進行對焦等場合十分有效。61點自動對焦一般會對距離最近的被攝體進行對焦，拍攝無規律運動的被攝體，或在重視快門時機的抓拍中使用都很方便。擴充套件自動對焦區域：周圍使用任意選擇的1個自動對焦點及其上、下和兩側的4點或周圍8點作為輔助自動對焦點進行對焦。適合在拍攝單點自動對焦難以追蹤的動態被攝體時使用，可以兼顧對焦精度與快門時機。即使被攝體脫離所選的中心對焦點也能夠透過聯動的4個或8個自動對焦點進行對焦，輔助對焦點的數量隨著被作為中心對焦點在畫面中的位置而變化。適合用於動態人像攝影和規律運動較多的體育攝影。區域自動對焦61個自動對焦點分為9個區域，使用區域內的1個或多個自動對焦點進行對焦。拍攝激烈運動的被攝體時比擴充套件自動對焦區域的模式有效，適合想要優先考慮構圖，同時又想高精度捕捉被攝體時使用。在所選區域內合焦於距離最近的被攝體，當被攝體覆蓋多個自動對焦點時，可用多個對焦點捕捉被攝體，以防止中途脫焦。在體育攝影等要捕捉朝相機跑來的領先選手或拍攝激烈運動的單個被攝體時可以發揮威力。另外也適用於重視快門時機的抓拍。