一、實驗目的
1、 瞭解纖維素酶的生產工藝和原理
2、掌握液體發酵和固體發酵工藝
3、學會DNS法測定還原糖含量的方法和原理
二、實驗原理
纖維素酶可以用於一切含纖維素的生物質的降解具有廣闊的應用前景。高產纖維素酶的微生物主要有木黴屬、麴黴屬、根黴屬黑麴黴所產的纖維素酶中β -葡萄糖苷酶活力高能避免酶解產物纖維二糖的阻遏作用而且安全無毒故而成為生產纖維素酶的主要菌種之一。纖維素酶是誘導酶故發酵生產時需有纖維素物質作誘導劑。
以羧甲基纖維素鈉作底物用發酵所得纖維素酶對底物進行酶解測定酶解液中的還原糖含量以葡萄糖計可以計算酶活力高低。還原糖與DNS反應形成棕色物質顏色深淺與糖含量成正比。
三、材料與試劑配製
1、生產菌種黑麴黴
2、斜面活化培養基酵母膏0.4%蛋白腖0.6%可溶性澱粉1%葡萄糖0.9%馬玲薯浸出液7%瓊脂2%陳海水或人工海水配製 pH7.0-7.4。
3、人工海水 NaCl = 24 g/L ;MgSO4 · 7H2 O= 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;Na2HPO4 =3.0 g/ L ,pH7.4。
4、微量元素液 FeSO4 · 7H2O 5.0mg/L MnSO4 ·H2O 1.6mg/L ZnSO4 · 7H2O 1.4mg/LCoCl2 2.0mg/L加蒸餾水200ml使之溶解。
5、液體發酵產酶培養基麩皮作碳源3 g氯化銨或硫酸銨作無機氮源1 g蛋白腖0.05g作有機氮源人工海水100 ml 含1%微量元素液 自然pH值。
6、 固體發酵產酶培養基麩皮稻草粉=2 1作碳源5 g人工海水12 ml 含1%微量元素液 1%氯化銨或硫酸銨 0.05%蛋白腖 自然pH值。
7、 6% DNS試劑稱取酒石酸鉀鈉182g溶於500ml水中加熱溶解於熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6g 20.8gNaOH,5g苯酚 5g無水亞硫酸鈉加熱攪拌溶解冷卻後定容至1000ml。儲存在棕色瓶中放置一週後使用。 提前配製
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8、 0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液pH 4.8
0. 1mol/L檸檬酸鈉溶液100mL:稱2.941克檸檬酸鈉(檸檬酸鈉的分子量為294. 12) 約20L蒸餾水溶解後轉入100mL溶量瓶定容至刻度。
0. 1mol/L檸檬酸溶液100mL:稱2. 101克檸檬酸(檸檬酸的分子量為210. 14) 約20L蒸餾水溶解後轉入100mL溶量瓶定容至刻度。pH4.8的檸檬酸鈉—檸檬酸緩衝液100mL:量取0. 1mol/L檸檬酸鈉溶液54mL和
0. 1mol/L檸檬酸溶液46mL混合搖勻。
9 1%CMC-Na溶液
稱取1.0克羧甲基纖維素納用pH 4.8的檸檬酸鈉—檸檬酸緩衝液加熱溶解。
10 1mg.mL-1標準葡萄糖溶液
1mg/mL葡萄糖溶液250mL:準確稱取無水葡萄糖250mg溶解定容到250ml。
11、主要儀器恆溫培養箱搖床培養箱可見光分光光度計、冷凍離心機、 電子天平等。
四、實驗步驟
1、培養基配製
分別按上述方法配製液體發酵培養基和固體發酵培養基 121℃滅菌20分鐘。
2、孢子懸液的製備將斜面培養基上的麴黴孢子用少量無菌人工海水洗下利用玻璃珠在磁力攪拌下攪拌15~20分鐘充分打散孢子稀釋成5x107個/ml左右的孢子懸液。
2、液體發酵產酶試驗
按6% v/v 接種量將濃度約為5×10 7個/ml的菌株孢子懸液接入已滅菌的液體發酵培養基100ml錐瓶裝液30ml 於35℃、 180r/min條件下搖床培養6天。發酵液4℃、5000 r/min離心15 min上清液稀釋10倍測定發酵液中的酶活力。
3、 固體發酵產酶試驗
100ml三角燒瓶裝5g已滅菌的固體發酵培養基按1:3(v/w)接種量將濃度約為5×107個/ml的菌株孢子懸液於35℃恆溫培養箱中培養接種48小時後隔天翻曲一次第四或第五天補充無菌水保持基質水分。培養6天后取發酵成熟曲1g加蒸餾水10ml攪拌均勻30℃浸提lh雙層紗布過濾濾液經4℃ 5000rmp離心15min上清為粗酶液。測定時適當分級稀釋使OD540在0.2~1.0範圍。
4、酶活力測定及酶活力定義
葡萄糖標準曲線繪製
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準確稱取無水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分別吸取此液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0ml至5個25ml的比色管中用蒸餾水定容到25ml (即加水24, 23, 22, 21, 20ml)
再分別吸取上溶液各2.5ml於比色管中糖液分別含糖量為0. 1,0.2,0.3,0.4,0.5mg各加2.5mlDNS試劑煮沸5min。 對照管2.5ml水代替糖液冷卻測定OD540。
表1葡萄糖標準曲線繪製加樣表
管號 1 2 3 4 5 6
蒸餾水mL 2.5 - - - - -
標準葡萄糖mL - 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNS mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
含糖量mg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
OD540
以糖含量為橫座標 A540為縱座標 或反過來繪製標準曲線。
1內切葡聚糖酶(CMCase)酶活取適當稀釋的酶液0.5 ml加入2.0 ml 1 (W/V)的CMC-Na溶液(溶於0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液 pH 4.8) 60℃反應30 min加入2.5 ml DNS終止反應沸水浴顯色5 min測定OD540。 以滅活酶液作對照。
2濾紙酶(FPA)酶活取50 mg (1Χ 6 cm)新華濾紙加入酶液0.5 ml再加入pH 4.8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液2.5 ml 50℃反應l h其它同前。
酶活力定義在上述反應條件下每分鐘催化底物水解生成1 µmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U) 。
酶活力=為由標準曲線查得或迴歸方程算得的還原糖含量 mg。
五、實驗記錄
1.固體培養基
6月20日接種 6月21日15點00分無現象 6月22日16點05分出現白色菌絲體 6月24日10點出現大量白色菌絲體和少量黑色孢子 6月25日8點出現大量黑色孢子 白色菌絲體比前天少些
2.液體培養基
6月20日接種 6月21日15點00分無現象 6月22日16點05分液體顏色變深了 6月24
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日10點液體變稠、變黑、 出現少量黑色孢子 6月25日8點出現大量黑色孢子
六、實驗資料
1.葡萄糖標準曲線OD資料
管號 1 2 3 4 5 6蒸餾水mL 2.5 - - - - -標準葡萄糖mL - 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
OD540 0.000 0.041 0.370 0.677 1.013 1.152
2.酶活力測定OD資料
七、資料處理
實驗資料 CMCase: OD540液體培養基=1.091 OD540固體培養基=0.497
FPA: OD540液體培養基=0.623 OD540固體培養基=0.695
一、實驗目的
1、 瞭解纖維素酶的生產工藝和原理
2、掌握液體發酵和固體發酵工藝
3、學會DNS法測定還原糖含量的方法和原理
二、實驗原理
纖維素酶可以用於一切含纖維素的生物質的降解具有廣闊的應用前景。高產纖維素酶的微生物主要有木黴屬、麴黴屬、根黴屬黑麴黴所產的纖維素酶中β -葡萄糖苷酶活力高能避免酶解產物纖維二糖的阻遏作用而且安全無毒故而成為生產纖維素酶的主要菌種之一。纖維素酶是誘導酶故發酵生產時需有纖維素物質作誘導劑。
以羧甲基纖維素鈉作底物用發酵所得纖維素酶對底物進行酶解測定酶解液中的還原糖含量以葡萄糖計可以計算酶活力高低。還原糖與DNS反應形成棕色物質顏色深淺與糖含量成正比。
三、材料與試劑配製
1、生產菌種黑麴黴
2、斜面活化培養基酵母膏0.4%蛋白腖0.6%可溶性澱粉1%葡萄糖0.9%馬玲薯浸出液7%瓊脂2%陳海水或人工海水配製 pH7.0-7.4。
3、人工海水 NaCl = 24 g/L ;MgSO4 · 7H2 O= 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;Na2HPO4 =3.0 g/ L ,pH7.4。
4、微量元素液 FeSO4 · 7H2O 5.0mg/L MnSO4 ·H2O 1.6mg/L ZnSO4 · 7H2O 1.4mg/LCoCl2 2.0mg/L加蒸餾水200ml使之溶解。
5、液體發酵產酶培養基麩皮作碳源3 g氯化銨或硫酸銨作無機氮源1 g蛋白腖0.05g作有機氮源人工海水100 ml 含1%微量元素液 自然pH值。
6、 固體發酵產酶培養基麩皮稻草粉=2 1作碳源5 g人工海水12 ml 含1%微量元素液 1%氯化銨或硫酸銨 0.05%蛋白腖 自然pH值。
7、 6% DNS試劑稱取酒石酸鉀鈉182g溶於500ml水中加熱溶解於熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6g 20.8gNaOH,5g苯酚 5g無水亞硫酸鈉加熱攪拌溶解冷卻後定容至1000ml。儲存在棕色瓶中放置一週後使用。 提前配製
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8、 0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液pH 4.8
0. 1mol/L檸檬酸鈉溶液100mL:稱2.941克檸檬酸鈉(檸檬酸鈉的分子量為294. 12) 約20L蒸餾水溶解後轉入100mL溶量瓶定容至刻度。
0. 1mol/L檸檬酸溶液100mL:稱2. 101克檸檬酸(檸檬酸的分子量為210. 14) 約20L蒸餾水溶解後轉入100mL溶量瓶定容至刻度。pH4.8的檸檬酸鈉—檸檬酸緩衝液100mL:量取0. 1mol/L檸檬酸鈉溶液54mL和
0. 1mol/L檸檬酸溶液46mL混合搖勻。
9 1%CMC-Na溶液
稱取1.0克羧甲基纖維素納用pH 4.8的檸檬酸鈉—檸檬酸緩衝液加熱溶解。
10 1mg.mL-1標準葡萄糖溶液
1mg/mL葡萄糖溶液250mL:準確稱取無水葡萄糖250mg溶解定容到250ml。
11、主要儀器恆溫培養箱搖床培養箱可見光分光光度計、冷凍離心機、 電子天平等。
四、實驗步驟
1、培養基配製
分別按上述方法配製液體發酵培養基和固體發酵培養基 121℃滅菌20分鐘。
2、孢子懸液的製備將斜面培養基上的麴黴孢子用少量無菌人工海水洗下利用玻璃珠在磁力攪拌下攪拌15~20分鐘充分打散孢子稀釋成5x107個/ml左右的孢子懸液。
2、液體發酵產酶試驗
按6% v/v 接種量將濃度約為5×10 7個/ml的菌株孢子懸液接入已滅菌的液體發酵培養基100ml錐瓶裝液30ml 於35℃、 180r/min條件下搖床培養6天。發酵液4℃、5000 r/min離心15 min上清液稀釋10倍測定發酵液中的酶活力。
3、 固體發酵產酶試驗
100ml三角燒瓶裝5g已滅菌的固體發酵培養基按1:3(v/w)接種量將濃度約為5×107個/ml的菌株孢子懸液於35℃恆溫培養箱中培養接種48小時後隔天翻曲一次第四或第五天補充無菌水保持基質水分。培養6天后取發酵成熟曲1g加蒸餾水10ml攪拌均勻30℃浸提lh雙層紗布過濾濾液經4℃ 5000rmp離心15min上清為粗酶液。測定時適當分級稀釋使OD540在0.2~1.0範圍。
4、酶活力測定及酶活力定義
葡萄糖標準曲線繪製
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準確稱取無水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分別吸取此液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0ml至5個25ml的比色管中用蒸餾水定容到25ml (即加水24, 23, 22, 21, 20ml)
再分別吸取上溶液各2.5ml於比色管中糖液分別含糖量為0. 1,0.2,0.3,0.4,0.5mg各加2.5mlDNS試劑煮沸5min。 對照管2.5ml水代替糖液冷卻測定OD540。
表1葡萄糖標準曲線繪製加樣表
管號 1 2 3 4 5 6
蒸餾水mL 2.5 - - - - -
標準葡萄糖mL - 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNS mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
含糖量mg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
OD540
以糖含量為橫座標 A540為縱座標 或反過來繪製標準曲線。
1內切葡聚糖酶(CMCase)酶活取適當稀釋的酶液0.5 ml加入2.0 ml 1 (W/V)的CMC-Na溶液(溶於0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液 pH 4.8) 60℃反應30 min加入2.5 ml DNS終止反應沸水浴顯色5 min測定OD540。 以滅活酶液作對照。
2濾紙酶(FPA)酶活取50 mg (1Χ 6 cm)新華濾紙加入酶液0.5 ml再加入pH 4.8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩衝液2.5 ml 50℃反應l h其它同前。
酶活力定義在上述反應條件下每分鐘催化底物水解生成1 µmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U) 。
酶活力=為由標準曲線查得或迴歸方程算得的還原糖含量 mg。
五、實驗記錄
1.固體培養基
6月20日接種 6月21日15點00分無現象 6月22日16點05分出現白色菌絲體 6月24日10點出現大量白色菌絲體和少量黑色孢子 6月25日8點出現大量黑色孢子 白色菌絲體比前天少些
2.液體培養基
6月20日接種 6月21日15點00分無現象 6月22日16點05分液體顏色變深了 6月24
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日10點液體變稠、變黑、 出現少量黑色孢子 6月25日8點出現大量黑色孢子
六、實驗資料
1.葡萄糖標準曲線OD資料
管號 1 2 3 4 5 6蒸餾水mL 2.5 - - - - -標準葡萄糖mL - 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNS mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
含糖量mg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
OD540 0.000 0.041 0.370 0.677 1.013 1.152
2.酶活力測定OD資料
七、資料處理
實驗資料 CMCase: OD540液體培養基=1.091 OD540固體培養基=0.497
FPA: OD540液體培養基=0.623 OD540固體培養基=0.695