原理

　　反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據溶質極性(疏水性)的差別進行溶質分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質也透過疏水性相互作用分配於固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質的洗脫分離。

　　溶質在反相介質上的分配係數取決於溶質的疏水性，一般疏水性越大，分配係數越大。當固定相一定時，可以透過調節流動相的組成調整溶質的分配係數。RPC主要應用於相對分子質量低於5000，特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可以用於蛋白質等生物大分子的分析和純化。由於反相介質表面為強烈疏水性，並且流動相為低極性的有機溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活，所以，以回收生物活性蛋白質為目的時，應注意選用適宜的反相介質。、

　　反相介質的商品種類繁多，其中最具代表性的是以矽膠為載體，透過表面鍵合非極性分子層製備。透過控制反應時間和溫度，可獲得性能穩定的反相介質。在矽膠基質的反相填料中，以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料最為常見，用途最廣。

　　RPC固定相大多是矽膠表面鍵合疏水基團，基於樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，新增一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相