豬圓環病毒(P orcine circ ovirus,PCV)為圓環病毒科圓環病毒屬的成員,屬單股環狀D NA 病毒。該病毒無囊膜,具20面體,平均直徑17nm,不具備血凝活性,可抵抗p H 值3的酸性環境,能在vero 細胞中生長繁殖,但不產生細胞病變。根據PC V 的致病性、抗原性或核苷酸序列,可將PCV 分為兩個型,即PC V -1和PCV -2。P CV -1無致病性,廣泛存在於豬群中[1-2]。

具致病性的P CV -2能引起多種疾病綜合症,如能引起仔豬斷奶後多系統衰竭綜合症(P MW S)、豬皮炎和腎炎綜合症、豬增生性壞死性間質性肺炎等,能與弓形體、附紅細胞體混合感染,同時能加劇諸如豬繁殖與呼吸綜合症、豬細小病毒病等的發生和流行[1]

。P CV -2廣泛存在於世界各地,對有些國家和地區養豬業造成的危害特別嚴重。

目前,診斷該病的方法雖多,但速度較慢,而P CR 技術可以在短時間內診斷出疾病。筆者根據GenBank 中的PC V -2序列設計出特異性引物,建立豬圓環病毒2型地方分離株的PCR 診斷方法,以期為快速診斷豬圓環病毒病提供參考。1 材料與方法

1.1 毒株 豬圓環病毒2型(P CV -2)陽性病料由河南科技學院獸醫院提供(經ELI SA 檢測確認為陽性);豬繁殖與呼吸綜合症病毒(P RRS V)、豬瘟病毒(HCV)、豬細小病毒(PP V)、豬流感病毒(SI V)均由河南科技學院預防獸醫學實驗室提供。1.2 工具酶和主要試劑 Taq D NA 聚合酶、dN TPs 、La dde r Mar ke r 、蛋白酶K 均購自T a Ka Ra 公司,SDS 、飽和酚、氯仿、無水乙醇均購自華美生物工程有限公司。

1.3 引物設計與合成 參照Ge nBa nk 上發表的20株PCV -2

的核苷酸序列,透過引物設計序列軟體P ri mier 5.0設計1對引物,上游引物為:5c -G GAG TCTG GTG ACCG TTGC -3c ;下游引物

為:5c -C TTCCTCCGTG GA TTG TTC T -3c ,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 PC V -2DNA 模板的製備[3]

取部分病料0.5~2.0g,研磨並用Hank .s 液(p H 值7.2~7.4)稀釋成1B 3乳劑,反覆凍融3次以上後,8000r/min 10min,取上清液於-20e 儲存備用。取病料上清液500L l,加入10%SD S 50L l,蛋白酶K 20L l,混勻後55e 水浴1h 。加800L l 苯酚混勻,12000r/min 5min 。取上清液,加苯酚、氯仿各300L l,混勻,12000r/min 5min 。取上清液,加等量氯仿,12000r/min 5min 。小心取上清液,加2倍無水乙醇及1/10體積的Na Ac,混勻後,置-20e 沉澱30min 以上,12000r/min 15min 。棄去上清液,然後加入200L l 75%酒精洗滌數次,37e 烘乾。加入30L l dd H 2O 溶解,作為PCR 反應的模板或-20e 儲存備用。

1.5 PCR 反應及條件的最佳化 P CR 反應的基本步驟按照5分子克隆實驗指南6[4]

進行,對反應體系中的dN TP 、酶、引物的濃度進行了最佳化。在25.00L l 體系中,10@Buffer 2.50L l,dN TP 2.00L l,模板1.00L l,D NA 聚合酶0.15L l,引物各1.00L l,d 2H 2O 17.35L l 。P CR 反應程式:94e 2min;94e 1min,50e 1min,72e 1min,30個迴圈,72e 10min;4e 儲存。1.6 電泳檢測 在1%瓊脂糖板(在50e 左右時,加入3L l 染料G OOD VIEW)上加入D L2000及PCR 產物,電壓為80V 。電泳結束後於紫外燈下觀察、拍照。1.7 PC R 的特異性實驗 將上述提取的P CV -2D NA 和用Tri zo l 試劑盒提取PR RSV 、HC V 、SI V 的c DN A 以及PP V 的D NA 進行PCR 擴增,引物為上述所設計的P CV -2D NA 的特異性引物,鑑定該方法的特異性。

1.8 PCR 的敏感性實驗 將所提取的D NA 用紫外分光光度計在260nm 處進行快速測定,核酸含量約為50ng,然後用滅菌雙蒸水進行10、20、40、80、160倍的稀釋,用上述實驗確

安徽農業科學,Journal of Anh ui Agri.Sci.2008,36(16):6678-6679,6700 責任編輯 孫紅忠 責任校對 盧瑤

定的PCR 最佳反應條件進行PCR 擴增。以出現陽性反應條帶的模板用量為最高稀釋倍數,推算可檢出最低病毒含量。2 結果與分析

2.1 PCR 條件的最佳化及電泳結果 透過對PCR 擴增條件的最佳化,得出各物質的最佳使用濃度:dN TP 的終濃度為220pmol/ml,Taq 酶的終濃度為0.1U/L l,引物的終濃度為20pmol/L l 。

用最佳化的條件對從陽性病料中提取的D NA 進行PCR 擴增。將PCR 反應後的產物在紫外燈下觀察,結果見圖1,在494bp 處出現1條特異性條帶,



與預期大小相符合。

注:M 為DL2000;1為PCR 產物。Note:M.D L2000;1.Product of PCR.

圖1 PCR 檢測結果Fig.1 T he results o f PC R detectio n

2.2 PC R 檢測PC V -2的特異性 應用所建立的方法同時

檢測PC V -2、PR RSV 、HC V 、SI V 、PP V,其中P CV -2檢測為陽性,PRR SV 、HC V 、SIV 、PP V 檢測均為陰性,未出現交叉反應,證明該方法具有良好的特異性,結果見圖2



。

注:M 為DL2000;1為PCV -2;2為PRRSV;3為HCV;4為SIV;5為PP V 。

Note:M.D L2000;1.PCV -2;2.PRRSV;3.HCV;4.SIV;5.PPV.

圖2 特異性檢測結果

Fig .2 The res ults o f s pecific d etection by PCR

。PC V -2感染可導致豬發生先天性震顫及豬皮炎腎病綜合症[1,3]。鑑於國內養豬規模的不斷擴大及與國際養豬業交流日益加強,很難保



證豬群中沒有PC V -2感染及其相關疾病的傳入。因此,正確

診斷是預防豬圓環病毒病的關鍵。

注:M 為DL2000;1為50.000ng DNA;2為5.000ng D NA;3為2.500

ng DNA;4為1.250ng DNA;5為0.625ng DN A;6為0.375ng D NA.

Note:M.DL2000;1.50.000ng DN A;2.5.000ng D NA;3. 2.500ng

D NA;4.1.250ng DNA;5.0.625ng D NA;6.0.375ng DNA.

圖3 敏感性檢測結果

Fig.3 The res ults o f s ensitiv ity detectio n by PCR

到目前為止,雖然眾多國外科研工作者對PCV 及其所導致的各種疾病進行了大量的研究,並取得了不小的進展,但是,國內對P CV 研究還處於起始階段[10]。迄今為止,該病的

疫苗正處於實驗階段,市場上還沒有商品化疫苗和特效藥物防治該病,並且該病有時呈亞臨床感染[7]。

由於該病原具有特殊性(動物攜帶病毒但不一定會發病),它主要侵害動物的免疫系統,導致其機體的免疫力下降,進而造成許多病原的繼發感染。目前主要採取的措施是加強飼養管理,定期消毒,嚴防P PV 、P RRS V 等引起疾病,降低飼養密度,堅持自繁自養,全進全出,引種豬時應慎重,加強早期疑似感染豬的診斷與淘汰[8]。除此之外,應建立一種快速、特異、簡便的檢測方法,為控制PC V 所致疾病的發生與流行提供技術保障。

3.2 豬圓環病毒的實驗室診斷 實驗室診斷PC V 的方法有很多種。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)具有重複性、特異性和敏感性較好的特點,適合於大規模的PC V -2抗體的快速診斷,同時可用於進出口檢驗檢疫的初篩,但往往存在假陽性偏高的問題[9]。通常用來診斷PCV -2的ELISA 方法包括間接ELISA 、競爭E LI SA 和抗原捕獲ELISA 等。間接免疫熒光

實驗(I FA)可用於豬圓環病毒感染的血清學普查[9],宜於檢測細胞培養物中的P CV 。原位核酸雜交(IS H )具有群特異

性,靈敏度較高,可以精確定位PCV 在組織器官及其細胞中的部位,可用於檢測臨床病料和病理分析,但不能區分PCV -1和PCV -2。免疫組化實驗(I HC)適合於病毒抗原在組織培養和機體細胞內生長定位的觀察。來源於不同地區的PCV -2分離株,其基因組序列有差異,這種差異對PC V -2的診斷和研究有重要意義。已有學者利用此差異建立了P CV -RF LP 方

法,以此來診斷PCV 感染[10]

。

3.3 PC R 檢測PCV -2 通常情況下,病毒病的確診均需進行病毒分離。但由於PC V 的病毒粒子很小(只有17nm),在細胞上不產生細胞病變,且需將P CV 盲傳多代才能使病毒有效增殖[2]。因此,病毒分離費力、耗時,不適於此病的快速診斷。國外已有多種市售診斷試劑盒,如ELISA 、間接免疫熒光