1、配製溶液
向容器內加入所需水量的一部分，按照培養基的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最後補足所需水分。
配製固體培養基時，先將上述已配好的液體培養基煮沸，再將稱好的瓊脂加入，繼續加熱至完全融化。並不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。
2、調節pH值
用pH試紙（或pH電位計、氫離子濃度比色計）測試培養基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH進行調節，直到調節到配方要求的pH值為止。
3、過濾
用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養基過濾。用紗布過濾時，最好摺疊成六層，用濾紙過濾時，可將濾紙摺疊成瓦稜形，鋪在漏斗上過濾。
4、分裝
已過濾的培養基應進行分裝。如果要製作斜面培養基，須將培養基分裝於試管中。如果要製作平板培養基或液體、半固體培養基，則須將培養基分裝於錐形瓶內。
分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養基流出，另一隻手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養基。分裝時，注意不要使培養基粘附管口或瓶口，以免浸溼棉塞引起雜菌汙染。
裝入試管的培養基量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般製作斜面培養基時，每隻15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如製作深層培養基，每隻20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每隻錐形瓶裝入的培養基，一般以其容積的一半為宜。
5、加棉塞
分裝完畢後，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免汙染。棉塞應採用普通新鮮、乾燥的棉花製作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。
製作棉塞時，要根據棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與姆指稍稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。
棉塞作成後，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應緊貼內壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺摺侵入。棉塞不要過緊過鬆，塞好後，以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的2/3應在管內或瓶內，上端露出少許棉花便於拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆札，準備滅菌。
6、製作斜面培養基和平板培養基
培養基滅菌後，如製作斜面培養基和平板培養基，須趁培養基未凝固時進行。
1、配製溶液
向容器內加入所需水量的一部分，按照培養基的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最後補足所需水分。
配製固體培養基時，先將上述已配好的液體培養基煮沸，再將稱好的瓊脂加入，繼續加熱至完全融化。並不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。
2、調節pH值
用pH試紙（或pH電位計、氫離子濃度比色計）測試培養基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH進行調節，直到調節到配方要求的pH值為止。
3、過濾
用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養基過濾。用紗布過濾時，最好摺疊成六層，用濾紙過濾時，可將濾紙摺疊成瓦稜形，鋪在漏斗上過濾。
4、分裝
已過濾的培養基應進行分裝。如果要製作斜面培養基，須將培養基分裝於試管中。如果要製作平板培養基或液體、半固體培養基，則須將培養基分裝於錐形瓶內。
分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養基流出，另一隻手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養基。分裝時，注意不要使培養基粘附管口或瓶口，以免浸溼棉塞引起雜菌汙染。
裝入試管的培養基量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般製作斜面培養基時，每隻15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如製作深層培養基，每隻20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每隻錐形瓶裝入的培養基，一般以其容積的一半為宜。
5、加棉塞
分裝完畢後，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免汙染。棉塞應採用普通新鮮、乾燥的棉花製作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。
製作棉塞時，要根據棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與姆指稍稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。
棉塞作成後，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應緊貼內壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺摺侵入。棉塞不要過緊過鬆，塞好後，以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的2/3應在管內或瓶內，上端露出少許棉花便於拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆札，準備滅菌。
6、製作斜面培養基和平板培養基
培養基滅菌後，如製作斜面培養基和平板培養基，須趁培養基未凝固時進行。