光學顯微標本的製作技術【實驗目的】瞭解光學顯微鏡切片製作技術的基本方法步驟。【實驗原理】採用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構，在自然狀態下是無法觀察清楚的，多數動、植物材料都必須經過某種處理，將組織分離成單個細胞或薄片，光線才能透過細胞。為了適應這個需要，就產生了光學顯微鏡製片技術。光學顯微鏡的製片技術方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。非切片法，是用物理或化學的方法，使細胞彼此分離，如有分離法、塗布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保侍細胞的完整，但是細胞之間的正常位置往往被更動，無法反映細胞之間的正常聯絡。它可以與切片法配合使用，各取其長處。切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁複。在製作過程中，還要經過一系列的物理和化學的處理，這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術複雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關係，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學顯微鏡的主要製片方法。【實驗儀器、材料和試劑】（一）儀器：石蠟切片機、恆溫蠟箱、載玻片、蓋玻片（二）材料：洋蔥根或小鼠肝（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚【方法與步驟】光學顯微鏡切片製作技術最簡單的切片法是徒手切片，但是由於組織塊往往十分柔軟，18切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支援作用，並將整個組織塊包住，然後再用精密的切片機制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑膠也可作為包埋劑。根據包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術。石蠟作為包埋劑，有其獨特的優點，例如：石蠟能切出極薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便於製作連續切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期儲存。然而石蠟切片的製作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受溼度影響比較大，這些不足之處必須在製片過程中認真對待，儘量減小它的不良影響。石蠟切片的製作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。（1）植物材料選擇時須儘可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死後迅速取出所需要的組織。（2）取材必須新鮮，這一點對於從事細胞生物學研究尤為重要，應該儘可能割取生活著的組織塊，並隨即投入固定液。（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。（4）切取的材料應該小而薄，便於固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。2．固定組織和細胞離開機體後，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸於死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須儘早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，並將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便於隨後的處理，還會改變細胞內部的折射係數並使某些部分易於染色。固定劑的作用物件主要是蛋白質，至於其他成分如脂肪和糖，在一般製作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特徵是：穿透組織的速度快。，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有儲存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、昇汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、昇汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。簡單固定劑的侷限性較大，如將其適當混合，製成複合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（昇汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據各種固定劑的效能及製片的不同要求來加以選擇。 19固定時，須注意以下幾點：（1）固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定後如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加控制，不能過長。（5）一般固定劑都以新配製的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合併者，一定要在使用前才混合。（6）固定完畢，根據所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉澱，影響以後組織塊的染色。3．脫水生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水後必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水後即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易於得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從30％乙醇開始，經過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對於一些柔軟的組織應從15％開始。脫水時間依據組織的型別和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要儲存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期儲存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。甘油常用於藻類、菌類及柔弱材料的脫水。二氧六環為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良後果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質、作用和用法同於正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。4．透明組織塊用非石蠟溶劑脫水後必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑後，石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不淨，就會引起不良後果，在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現透明狀態，如組織中有白色雲霧狀，說明脫水不淨，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應避免其揮發和吸收空氣中的水分，並保持其無水狀態。 20甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。苯的用法同於二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適於大塊組織的透明。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。鑑別石蠟質量的方法是：將石蠟熔化後倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔後再用，方法是將石蠟放入鍋內，加熱到開始冒白煙，然後用小火繼續加熱30min（注意別超過發火點），使其去除水分和揮發性雜質，並在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟須在恆溫箱中進行，恆溫箱的溫度調節至高於石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。透明的關鍵是控制溫度的恆定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟凝固無法滲透，溫度過高使組織收縮發脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固後立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min後取出。包埋用蠟的溫度應略高於透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以後切片時引起碎裂。6．切片（1）石蠟塊的固著與整修在包埋以後，就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。固著：一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊貼上於固著物上，並使組織塊朝外，便於以後迅速切出所需的片子。整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便於在蠟帶上識別切片。（2）切片機和切片刀切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械，常用的是旋轉式切片機，它的夾物部分是上下移動前後推進的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉動轉輪，標本臺上下運動並按調好的切片厚度向前推進一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢後應及時用二甲苯將石蠟油擦淨。（3）切片方法切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，並讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣後鬆開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指標不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，並托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度後，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放於襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本臺後移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦淨。（4）切片中存在的問題及補救方法石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由於某種因素而造成切片的質量低劣，甚至完全失敗。現將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法列於表1-3。表1-3 石蠟切片可能產生的問題和解決方法缺 點：石蠟帶彎曲不直原 因：1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，區域性產生差異4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正補 救 辦 法 ：1．取下臺木，將兩邊修幹2．調節標本臺，使兩者平行3．移動刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻後再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟缺 點：切片分離、不能連成帶狀原 因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合補 救 辦 法 ：1．在切片機上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面3．重新包埋4．矯正刀的角度缺 點：切片捲起呈圓筒狀原 因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大補 救 辦 法 ：1．提高室溫2．加軟蠟3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3 片即成帶4．減小傾角缺 點：切片粘附於切片刀，皺摺在一起原 因：1．室溫過高2．石蠟過軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍補 救 辦 法 ：1．降低室溫2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動刀口缺 點：切片縱裂原 因：1．刀有缺口2．石蠟塊中含有顆粒、雜質3．刀口留有碎屑或細絲4．組織太硬補 救 辦 法 ：1．可移動刀口2．將顆粒拽去3．清潔刀口4．讓包埋塊在水中浸泡缺 點：切片有橫紋原 因：1．刀和臺木的固定螺絲太鬆2．刀口傾斜度太大3．刀口有石蠟屑補 救 辦 法 ：1．旋緊螺旋2．可放平1—2。後再切3．用氯仿拭去缺 點：切片厚薄不勻原 因：1．切片機有毛病2．夾刀不當3，未旋緊標本臺螺旋4。石蠟塊過硬補 救 辦 法 ：1．矯正切片機裝置2．對症治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡缺 點：每張切片厚薄不勻原 因：1．刀口震動，是由於材料過硬2．刀的傾角太大補 救 辦 法 ：1。在蠟塊表面塗一層火棉膠2．減小傾角缺 點：材料發生裂隙破碎或脫落原 因：1．脫水不乾淨2．有透明劑殘留3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長4．由於脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發脆5．材料太硬或太粗補 救 辦 法 ：1．無法彌補2．增加浸蠟時間，重新包埋3．無法補救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明5．在蠟塊表面塗一薄層火棉膠溶液 缺 點：切片時發生沙沙聲原 因：1．組織塊過硬2．包埋溫度過高3，材料內留有結晶體補 救 辦 法 ：1．浸泡水中軟化2．無法補救3．無法補救缺 點：石蠟塊將蠟帶抬起原 因：1．由於摩擦而產生靜電荷所致2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑3．刀口上附有石蠟碎屑補 救 辦 法 ：1．提高室溫2．用刀片將碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．貼片切好的切片必須貼附於載玻片上才能作進一步處理，但是切片常有細小的橫紋，必須經展平後才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由於表面張力的作用使切片自然展平，然後用塗有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調打成雪花狀泡沫，然後用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最後加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可儲存幾個月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，於室溫下放置一晝夜後使其徹底乾燥。燙板法，是將塗有粘片劑的載玻片上塗上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片於35℃恆定的燙板上讓切片攤幹，並傾斜或用吸水紙吸去水分，最後將載玻片再度放燙板上晾乾。要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔淨，不能有油汙（檢驗法：已塗有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水，若發現水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應朝下，否則染色過程中切片容易脫落。8．染色組織切片是無色透明的，必須進行染色後才能觀察到各種微細結構。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經過脫蠟而再度覆水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由於切片十分菲薄，處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。染色是一個複雜的過程，兼有物理和化學作用，對其中的機制目前瞭解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應，顯示RNA的Brachet反應，顯示多糖的PAS反應，顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據不同的要求來選用。9．透明染色後的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明後，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。10．封藏封藏的目的是使製成的切片能夠永久儲存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出後，吸去多餘的二甲苯，在標本上的二甲苯尚未乾透之前加一滴樹膠，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，也不得拖動蓋玻片，以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。貼上標籤，註明材料、染色法，待封藏劑凝固後便成為一張成功的石蠟切片。
光學顯微標本的製作技術【實驗目的】瞭解光學顯微鏡切片製作技術的基本方法步驟。【實驗原理】採用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構，在自然狀態下是無法觀察清楚的，多數動、植物材料都必須經過某種處理，將組織分離成單個細胞或薄片，光線才能透過細胞。為了適應這個需要，就產生了光學顯微鏡製片技術。光學顯微鏡的製片技術方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。非切片法，是用物理或化學的方法，使細胞彼此分離，如有分離法、塗布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保侍細胞的完整，但是細胞之間的正常位置往往被更動，無法反映細胞之間的正常聯絡。它可以與切片法配合使用，各取其長處。切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁複。在製作過程中，還要經過一系列的物理和化學的處理，這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術複雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關係，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學顯微鏡的主要製片方法。【實驗儀器、材料和試劑】（一）儀器：石蠟切片機、恆溫蠟箱、載玻片、蓋玻片（二）材料：洋蔥根或小鼠肝（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚【方法與步驟】光學顯微鏡切片製作技術最簡單的切片法是徒手切片，但是由於組織塊往往十分柔軟，18切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支援作用，並將整個組織塊包住，然後再用精密的切片機制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑膠也可作為包埋劑。根據包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術。石蠟作為包埋劑，有其獨特的優點，例如：石蠟能切出極薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便於製作連續切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期儲存。然而石蠟切片的製作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受溼度影響比較大，這些不足之處必須在製片過程中認真對待，儘量減小它的不良影響。石蠟切片的製作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。（1）植物材料選擇時須儘可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死後迅速取出所需要的組織。（2）取材必須新鮮，這一點對於從事細胞生物學研究尤為重要，應該儘可能割取生活著的組織塊，並隨即投入固定液。（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。（4）切取的材料應該小而薄，便於固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。2．固定組織和細胞離開機體後，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸於死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須儘早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，並將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便於隨後的處理，還會改變細胞內部的折射係數並使某些部分易於染色。固定劑的作用物件主要是蛋白質，至於其他成分如脂肪和糖，在一般製作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特徵是：穿透組織的速度快。，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有儲存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、昇汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、昇汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。簡單固定劑的侷限性較大，如將其適當混合，製成複合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（昇汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據各種固定劑的效能及製片的不同要求來加以選擇。 19固定時，須注意以下幾點：（1）固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定後如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加控制，不能過長。（5）一般固定劑都以新配製的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合併者，一定要在使用前才混合。（6）固定完畢，根據所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉澱，影響以後組織塊的染色。3．脫水生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水後必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水後即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易於得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從30％乙醇開始，經過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對於一些柔軟的組織應從15％開始。脫水時間依據組織的型別和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要儲存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期儲存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。甘油常用於藻類、菌類及柔弱材料的脫水。二氧六環為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良後果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質、作用和用法同於正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。4．透明組織塊用非石蠟溶劑脫水後必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑後，石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不淨，就會引起不良後果，在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現透明狀態，如組織中有白色雲霧狀，說明脫水不淨，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應避免其揮發和吸收空氣中的水分，並保持其無水狀態。 20甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。苯的用法同於二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適於大塊組織的透明。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。鑑別石蠟質量的方法是：將石蠟熔化後倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔後再用，方法是將石蠟放入鍋內，加熱到開始冒白煙，然後用小火繼續加熱30min（注意別超過發火點），使其去除水分和揮發性雜質，並在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟須在恆溫箱中進行，恆溫箱的溫度調節至高於石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。透明的關鍵是控制溫度的恆定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟凝固無法滲透，溫度過高使組織收縮發脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固後立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min後取出。包埋用蠟的溫度應略高於透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以後切片時引起碎裂。6．切片（1）石蠟塊的固著與整修在包埋以後，就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。固著：一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊貼上於固著物上，並使組織塊朝外，便於以後迅速切出所需的片子。整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便於在蠟帶上識別切片。（2）切片機和切片刀切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械，常用的是旋轉式切片機，它的夾物部分是上下移動前後推進的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉動轉輪，標本臺上下運動並按調好的切片厚度向前推進一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢後應及時用二甲苯將石蠟油擦淨。（3）切片方法切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，並讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣後鬆開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指標不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，並托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度後，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放於襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本臺後移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦淨。（4）切片中存在的問題及補救方法石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由於某種因素而造成切片的質量低劣，甚至完全失敗。現將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法列於表1-3。表1-3 石蠟切片可能產生的問題和解決方法缺 點：石蠟帶彎曲不直原 因：1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，區域性產生差異4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正補 救 辦 法 ：1．取下臺木，將兩邊修幹2．調節標本臺，使兩者平行3．移動刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻後再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟缺 點：切片分離、不能連成帶狀原 因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合補 救 辦 法 ：1．在切片機上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面3．重新包埋4．矯正刀的角度缺 點：切片捲起呈圓筒狀原 因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大補 救 辦 法 ：1．提高室溫2．加軟蠟3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3 片即成帶4．減小傾角缺 點：切片粘附於切片刀，皺摺在一起原 因：1．室溫過高2．石蠟過軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍補 救 辦 法 ：1．降低室溫2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動刀口缺 點：切片縱裂原 因：1．刀有缺口2．石蠟塊中含有顆粒、雜質3．刀口留有碎屑或細絲4．組織太硬補 救 辦 法 ：1．可移動刀口2．將顆粒拽去3．清潔刀口4．讓包埋塊在水中浸泡缺 點：切片有橫紋原 因：1．刀和臺木的固定螺絲太鬆2．刀口傾斜度太大3．刀口有石蠟屑補 救 辦 法 ：1．旋緊螺旋2．可放平1—2。後再切3．用氯仿拭去缺 點：切片厚薄不勻原 因：1．切片機有毛病2．夾刀不當3，未旋緊標本臺螺旋4。石蠟塊過硬補 救 辦 法 ：1．矯正切片機裝置2．對症治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡缺 點：每張切片厚薄不勻原 因：1．刀口震動，是由於材料過硬2．刀的傾角太大補 救 辦 法 ：1。在蠟塊表面塗一層火棉膠2．減小傾角缺 點：材料發生裂隙破碎或脫落原 因：1．脫水不乾淨2．有透明劑殘留3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長4．由於脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發脆5．材料太硬或太粗補 救 辦 法 ：1．無法彌補2．增加浸蠟時間，重新包埋3．無法補救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明5．在蠟塊表面塗一薄層火棉膠溶液 缺 點：切片時發生沙沙聲原 因：1．組織塊過硬2．包埋溫度過高3，材料內留有結晶體補 救 辦 法 ：1．浸泡水中軟化2．無法補救3．無法補救缺 點：石蠟塊將蠟帶抬起原 因：1．由於摩擦而產生靜電荷所致2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑3．刀口上附有石蠟碎屑補 救 辦 法 ：1．提高室溫2．用刀片將碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．貼片切好的切片必須貼附於載玻片上才能作進一步處理，但是切片常有細小的橫紋，必須經展平後才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由於表面張力的作用使切片自然展平，然後用塗有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調打成雪花狀泡沫，然後用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最後加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可儲存幾個月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，於室溫下放置一晝夜後使其徹底乾燥。燙板法，是將塗有粘片劑的載玻片上塗上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片於35℃恆定的燙板上讓切片攤幹，並傾斜或用吸水紙吸去水分，最後將載玻片再度放燙板上晾乾。要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔淨，不能有油汙（檢驗法：已塗有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水，若發現水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應朝下，否則染色過程中切片容易脫落。8．染色組織切片是無色透明的，必須進行染色後才能觀察到各種微細結構。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經過脫蠟而再度覆水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由於切片十分菲薄，處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。染色是一個複雜的過程，兼有物理和化學作用，對其中的機制目前瞭解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應，顯示RNA的Brachet反應，顯示多糖的PAS反應，顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據不同的要求來選用。9．透明染色後的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明後，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。10．封藏封藏的目的是使製成的切片能夠永久儲存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出後，吸去多餘的二甲苯，在標本上的二甲苯尚未乾透之前加一滴樹膠，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，也不得拖動蓋玻片，以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。貼上標籤，註明材料、染色法，待封藏劑凝固後便成為一張成功的石蠟切片。