中國非洲豬瘟疫苗研製在今年4月實驗室研究工作取得成功後，今年8月，疫苗研發工作又取得了新的重要進展。一株雙基因缺失弱毒活疫苗已完成了實驗室安全評估與有效試驗，突破了規模化生產技術瓶頸，近期已向農業農村部提出生物安全評價申請，即將進入臨床試驗階段

目前全球8個國家15個研究所正致力於ASFV（非洲豬瘟病毒）疫苗研發。中國於2019年1月也啟動了ASF病毒基因缺失活疫苗研發專案。全球首個ASF病毒基因Ⅱ型毒株野豬口服疫苗(屬於ASFV基因突變疫苗)，於2019年3月被西班牙國家暨世界動物衛生組織(OIE)非洲豬瘟病毒研究實驗室主任、馬德里康普頓斯大學獸醫衛生監測中心教授何塞.馬紐埃爾比.桑切斯.斯凱諾(Jose Manuel Sanchez-Vizcoino)研製，在野豬上小試成功，取得92%的保護率效果，雖然還未進行家豬試驗，但給大家看到了戰勝非洲豬瘟的曙光。

中國有防治非洲豬瘟科技實力，有三大國家級防控動物疫病科研機構：國家外來動物疫病研究中心、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所和中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所。國家外來動物疫病研究中心為國家外來動物疫病技術支撐單位，負責外來動物疫病的系統研究、診斷、檢測、監測及風險分析及防控策略研究。哈爾濱獸醫研究所和蘭州畜牧與獸藥研究所有國家級動物疫苗、獸藥研究實驗室，有能力研製非洲豬瘟疫苗和有效藥物。

2019年5月24日傳來喜訊，由中國農科院哈爾濱獸醫研究所自主研發的非洲豬瘟疫苗取得階段性成果。中國在非洲豬瘟疫苗創制階段主要取得5項進展：（1）分離中國第一株非洲豬瘟病毒，建立了病毒細胞分離及培養系統和動物感染模型，對其感染性、致病力和傳播能力等生物學特性進行了較為系統的研究。2019年3月25日哈爾濱獸醫研究所公佈:參加攻關組的趙東明，劉任強等人利用2018.9.3黑龍江佳木斯疫情發病豬樣品，接種豬原代肺泡巨噬細胞，成功分離出中國第一個非洲豬瘟病毒毒株(Pig/HLJ/18)。（2）創制了非洲豬瘟候選疫苗，實驗室階段研究證明其中兩種候選疫苗株具有良好的生物安全性和免疫保護效果。（3）兩種候選疫苗株體外和體內遺傳穩定性強。分別將兩種候選疫苗株在體外原代細胞中連續傳代，其生物學特性及基因組序列無明顯改變，豬體內連續傳代，也未發現明顯毒力返強現象。（4）明確了最小保護接種劑量，證明大劑量和重複劑量接種安全。（5）臨床前中試產品工藝研究初步完成，已建立兩種候選疫苗的生產種子庫，初步完成了疫苗生產種子批純淨性及外源病毒檢驗，初步優化了候選疫苗的細胞培養及凍幹工藝。中國非洲豬瘟疫苗研究成果處於國際領先地位。

中國農科院非洲豬瘟防控科技攻關專案組已完成了非洲豬瘟病毒全基因組測定，篩選出多個天然免疫抑制性病毒基因，完成部分基因免疫抑制機制研究；研製出檢測速度快、敏感性及特異性高、穩定性好的病毒核酸和抗原類快速檢測試劑盒。研究人員還採集到拉合爾鈍緣蜱、全溝硬蜱、草原革蜱等12個蜱種，進行人工培養和生活史觀察，篩選出快速消殺化學藥物新組方和植物源殺蟲劑有效組方；篩選出複合季銨鹽消毒劑配方，完成了中試生產研究。下一步將在實驗室階段研究進展的基礎上，加快推進中試與臨床試驗以及疫苗生產的各項研究工作，儘快完成免疫機制、診斷檢測、消毒滅蟲技術等方面的研究。

這些重大科研專案成果來之不易。中國農業科學院在中國發生非洲豬瘟後，第一時間組建非洲豬瘟防控科技攻關專案組，由哈爾濱獸醫研究所牽頭，蘭州獸醫研究所、北京畜牧獸醫研究所、上海獸醫研究所、蘭州畜牧與獸藥研究所、中國農科院飼料研究所為成員單位，集聚精幹力量組建攻關團隊，並設立科技創新專項經費支援，以疫苗研發為重點，夜以繼日，加班加點，緊急開展疫苗、免疫機制、診斷檢測、消毒滅蟲技術等聯合攻關。解讀中國農業科學院《非洲豬瘟防控科研計劃(2018一2022)》，就是成立非洲豬瘟防控科技攻關專案組，進行研發疫苗為主要內容的科研計劃。科研計劃提到非洲豬瘟研發疫苗型別為基因缺失疫苗和活載體疫苗兩類。基因缺失疫苗也就是基因重組疫苗(基因工程疫苗)，活載體疫苗就是減毒疫苗。

2 對病毒自然減毒繼代傳播致弱規律的研究

病毒都有從強毒到弱毒的過程，只不過存在致弱的時間長短問題。從流行病學角度對人SARS、羊PPR、豬PRRS分析，2003年人SARS在中國流行了7個月，其中3個月高發期。高致病性豬藍耳病從2006年6月流行到2007年10月，流行了14個月，其中高發期有5個月(2006年6—10月)。中國羊PPR在2014年流行了11個月，其中高發期有3個月(2014年3—5月)。暴發疫情時都沒有疫苗和有效藥物，政府採取限制流動，隔離對症治療，對疫病羊、豬撲殺無害化處理等防控措施，加之病毒自然減毒繼代傳播致弱規律，疫情都得到了控制。也許，這個病毒自然減毒繼代傳播致弱規律會讓非洲豬瘟在疫苗和有效藥物產品出世之前，就得到了控制。

病例一：2003年中國暴發SARS疫情

2002年11月16日廣東順德發生首例，暴發高峰期為2003年3-5月，7月中旬基本結束。中國內地共發病病例5327例，死亡348人。當時也沒有SARS疫苗和有效藥物，造成社會極大恐慌，在廣東等地出現搶購藥物板藍根和白醋現象。採取對病人送醫院隔離對症（肺炎）治療，劃定疫區，限制疫區人員流動，對直接接觸病人疑似人員就地隔離觀察，有發熱症狀的送當地醫院隔離治療等防控措施。

SARS疫苗於2003年3月開始研發，至2004年11月研製出初級疫苗，36名青年志願者和9名疫苗研發人參加臨床試驗，證實了無副作用和疫苗安全性。人用SARS滅活疫苗，研製成功花時2.5年，被證實免疫有效期為3年，準備再次發生SARS時，用於區域性或大面積推廣。

病例二：2006年中國暴發PRRS疫情

自2006年6月開始，中國南方省份發生豬“高熱病”。6-9月為暴發期，有300多萬頭髮病，死亡數達10%~30%，有的高達50%以上。透過科研單位開展流行病學調查，病源分離鑑定、動物試驗等科技攻關，查明疫情是由PRRSV（豬繁殖與呼吸障礙綜合徵病毒）的變異株引起，2007年4月，農業部正式確定為“豬繁殖與呼吸障礙綜合徵”。

2008年3月研製了PRRS滅活疫苗，2009年1月研製了PRRS減毒疫苗。2009年把PRRS疫苗列入中國強制免疫疫種。

病例三：2014年中國暴發PPR疫情

農業部獸醫局（現為農業農村部）2014年5月15日釋出的疫情訊息，2014年1－5月全國先後有22省市（直轄市）暴發PPR疫情，先後依次發生為：新疆、甘肅、內蒙古、寧夏、遼寧、湖南、安徽、江西、江蘇、廣西、吉林、重慶、四川、湖北、浙江、山西、黑龍江、貴州、雲南、陝西、河南、廣東，佔31個省的71.0%，PPR疫情已死亡羊和撲殺羊65526只)。其中2014年4月1日至15日發生163起，發病2.388萬隻，病死1.09萬隻，撲殺無害化處理3.3萬隻。病死撲殺數為4.39萬隻，佔1—5月病死撲殺總數65526只的67.0%。2014年下半年疫情減少，2015年只發生7例:湖南衡陽（5月）、廣西河池（5月）、吉林遼源（5月）、貴州六盤水(5月)，西安（5月），江西贛州（8月），貴州安順（9月）。2016年只發生1例:江蘇南通(1月)。

當時只有新疆天康畜牧生物技術股份有限公司等2家公司生產PPR弱毒疫苗(減毒疫苗），沒有形成量產，所以只西藏和新疆免疫了PPR疫苗（2007年西藏發生首例PPR，2013年前只有西藏和新疆2個邊境地區發生PPR）。2015年1月從上述2家疫苗廠調劑了部分PPR疫苗，給2014年發生過疫情的縣市免疫，如湖南省洞口縣2015年免疫了1.5萬隻，佔存欄9.5萬隻數的15.8%，即免疫密度為15.8%。2016年擴大廠家疫苗生產，才把PPR列入全國強制免疫疫種。

3 做好抗擊非洲豬瘟持久戰的準備

由於非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，擁有雙鏈DNA結構，結構複雜、基因組龐大，24個基因型；病毒編碼超過150多種蛋白。基因不穩定，隨時有突變的可能。引用哈獸所研發人的話：“動物有細胞免疫和體液免疫。不同動物疫苗的研發難點不一樣，非洲豬瘟疫苗難點在於滅活疫苗不好用。”以前滅活苗能夠起保護作用，主要是體液免疫佔了主要作用，產生中和抗體就能保護。對於非洲豬瘟而言，體液免疫只是產生部分保護，還需要起很大作用的細胞免疫。正常的病毒都有很好的細胞系進行擴增，非洲豬瘟病毒卻沒有，需要豬原代細胞進行培養，意味著需要很多SPF豬的臟器來進行非洲豬瘟病毒的培養。因此國際專家Linda Dixon博士認為，對於非洲豬瘟而言，研製時間最短的滅活疫苗用不了，需要活疫苗——減毒活疫苗或基因工程疫苗，結論是：非洲豬瘟疫苗研發完成或需8年。所以中國農科院制定《非洲豬瘟防控科研計劃(2018一2022)》，定到2022年，就是考慮到了非洲豬瘟疫苗研發有很大難度。但非洲豬瘟疫苗研發取得階段性成果，極大鼓舞了華人戰勝非洲豬瘟的信心，特別是養豬人的信心。

筆者認為：中國有強大的疫苗研發科技實力，加上攻關專案組專家加班加點，富有吃苦耐勞精神，能攻克難關，極大縮短研發時間，相信中國最終形成非洲豬瘟疫苗產品在2年內就可以完成。

3.2 中國邊境國家和國際防控非洲豬瘟形勢嚴峻

俄羅斯2007年發現非洲豬瘟以來，至2019年一直沒有撲滅。2019年東南亞國家越南、高棉非洲豬瘟疫病淪陷，並有向北美洲傳播可能性。據農業農村部網站訊息，2019年5月14日越南新發2121起非洲豬瘟疫情。自2019年2月19日，越南公佈首次非洲豬瘟疫情以來，僅僅3個月，累計發生非瘟疫情2332起，已撲殺生豬120萬頭，佔生豬總數的4%。分析疫情的暴發原因是市場售賣病豬和撲殺病豬沒有深埋無害化處理，甚至把死豬扔進河裡，導致病源傳播。中國動物衛生與流行病學中心副主任黃保續分析非洲豬瘟跨國境傳入途徑主要有4類:生豬及產品國際貿易和走私、國際旅客攜帶豬肉及產品、國際運輸工具上的餐廚剩餘物、野豬遷徒。早在首發病例的2018年8月7日國家外來動物疫病研究中心就完成了首發病例的非洲豬瘟病毒瀋陽毒株基因排序檢測，B646L/p72基因序列417個鹼基與俄羅斯毒株100%匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的喬治亞毒株（Georgia 2007）屬於同一進化分支勢，懷疑從俄羅斯跨國境傳入。

3.3 建立防控非洲豬瘟中國模式

防控非洲豬瘟沒有固定的模式。借鑑2003年防控人非典型肺炎(SARS)措施和國外防控非洲豬瘟經驗，中國建立了分割槽域防控，加強“種豬場、規模場”兩場以及周邊地區非洲豬瘟緊急排查，加強養豬場生物安全體系建設，“點對點”生豬調運，運載工具備案消毒以及運輸路線管理，外調生豬和屠宰場生豬及其產品非洲豬瘟病毒檢測，加強官方獸醫配置和產地檢疫、屠宰檢疫，打擊豬肉產品走私，禁止餐廚剩餘物餵豬，疫病豬撲殺無害化處理以及對撲殺無害化處理豬給予每頭1200元財政補貼，設立公路（含高速公路）動物檢疫站等防控非洲豬瘟模式。全國非洲豬瘟疫情呈現多點散發、趨於平穩、防控有效、總體可控的態勢。2019年1月以來，中國非洲豬瘟傳播速度放緩、疫情總體可控的成績，世界人民有目共睹。防控非洲豬瘟中國模式，向全世界國家提供了借鑑模式。

4 總結

鑑於國際防控非洲豬瘟嚴峻形勢以及防控非洲豬瘟疫苗和有效藥物產品還需2年以上時間，華人必須做好抗擊非洲豬瘟持久戰的準備。

本研究以中國首例非洲豬瘟疫情中分離的流行毒株 (SY18)為親本株構建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株，針對基因缺失株的安全性和免疫保護效果進行了特性研究。結果顯示MGF和CD2v雙基因缺失株對豬安全，接種豬能夠100%抵抗親本毒株SY18株的攻擊，對照豬全部死亡。

非洲豬瘟(AfricanSwineFever,ASF) 是由非洲豬瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus,ASFV)感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，家豬病死率可高達。該病於1921年首先發現於肯亞，20世紀50年代從非洲溢位傳播到歐洲，20世紀90年代在歐洲被消除後，2007年再次從東非傳播到東歐國家喬治亞。自此，該病在東歐廣泛傳播，並在2017年傳播到俄羅斯伊爾庫斯克地區。目前50多個國家存在 ASF散發或暴發。2018年8月初，中國首次報告非洲豬瘟疫情。中國是全球養豬和豬肉消費第1大國，養殖密度高，養殖總量大，生豬年存欄6億頭，佔世界豬存欄總量的50%。但中國生豬養殖水平參差不齊，養殖場等相關產業生物安全存在諸多漏洞。因此，ASF傳入中國後，迅速傳播，迄今，已在31個省市區出現疫情報告，防控形勢嚴峻複雜。

由於 ASF 可給養豬業造成毀滅性打擊，因此，非洲豬瘟疫苗研究從未間斷。但由於 ASFV 結構複雜，病毒感染和免疫機制不清，儘管針對 ASF疫苗的研究起始於20世紀60年代末，近年來報道也很多，但尚未成功應用於實際。迄今，國際上採用基因工程手段獲得了多個 ASFV 基因缺失疫苗候選株，以及透過細胞傳代致弱和從自然界分離弱毒株的方法獲得了弱毒疫苗候選株，其中一些疫苗候選株在研究報道中針對同源病毒株攻擊有50%~100%保護率，但對異源病毒的攻擊保護效果不甚理想。

此外，無論是人工基因缺失弱毒株還是自然缺失弱毒株，豬免疫後出現劑量依賴性副反應，免疫豬出現精神沉鬱，食慾降低，發熱、病毒血症、高丙球蛋白血癥、肺炎、關節腫脹、跛行、慢性病變和僵豬等，降低了疫苗的實際使用價值。人工基因缺失株儘管具有很好的免疫標記，但基因缺失疫苗的有關報道不多。目前人們普遍關心的是非洲豬瘟基因缺失株和自然弱毒株作為疫苗的安全性問題。中國由於種種原因針對非洲豬瘟疫苗研究和儲備嚴重滯後。非洲豬瘟疫情發生後，非洲豬瘟疫苗的研究再次提上日程，儘管根據國外報道國內多位傳染病學者對非洲豬瘟疫苗研究和應用持擔心甚至懷疑態度，但中國現有國情決定了中國現階段應走疫苗免疫防控路線。

ASFV 擁有超大基因組，長160~190kb，編碼160多種蛋白，其中50多種為結構蛋白。病毒編碼的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，但目前透過與自然弱毒株基因組序列的比較和分析等方法確認的與免疫抑制有關的基因只有少數幾種，包括CD2v、MGF、9GL等。在已經報道的自然弱毒株和構建的基因缺失株當中，研究較多的是MGF和 CD2v基因缺失株。本研究利用國內報道的第1起疫情的病毒分離株 SY18株首先構建了 MGF、CD2v單基因缺失和二者的雙基因缺失共3株重組病毒。動物安全性和免疫效果試驗證明，MGF基因單缺失和 MGF、CD2v雙基因缺失毒株對免疫豬既具良好的安全性又呈現很好的攻毒保護效果，現將相關研究結果報告如下：

首先構建同源重組用質粒。從 ASFV 流行株SY18株基因組中擴增獲得 CD2v和 MGF 基因側翼各1200bp 序 列 作 為同源重組質粒同源臂。CD2v兩側翼片段間克隆有綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP) 基因，MGF 兩側翼片段中克隆紅色熒光蛋白(redfluorescentproGtein，RFP)基因表達框。

之後進行重組病毒拯救和純化。將二者的同源重組質粒(2μg)分別轉染6孔細胞培養板中的豬的原代肺泡巨噬細胞培養物(細胞數約為105個)，4h後感染SY18株(1 MOI)，48h後挑取熒光細胞(含有重組病毒)，經3輪有限稀釋法純化篩選，分別獲得了 ASFV SY18ΔCD2v、ASFV SY18ΔMGF 和ASFVSY18ΔMGF/ΔCD2v共3株基因缺失病毒。對拯救的重組病毒進行 PCR 鑑定和序列分析以及純淨性檢驗，證明我們成功獲得了CD2v和 MGF單基 因 缺 失 毒 株 (ASFV SY18ΔCD2v 和 ASFVSY18ΔMGF) 及 二 者 雙 基 因 缺 失 毒 株 (ASFVSY18ΔMGF/ΔCD2v。病毒的總體構建策略如圖1所示。

最後開展了重組病毒特性研究。共用35只健康豬，均分為7組，分別接種3株病毒的2種接毒劑量，具體接種方案如表1。

記錄7組豬的體溫和臨床表現，並對免疫豬血液、糞、唾液進行ASFV核酸PCR檢測。結果表明，組1和組2中豬接種ASFV SY18ΔCD2v毒株後次日起體溫出現升高，高達 42℃ 以上，3~5d內全部死亡。說明CD2v單基因缺失沒有明顯致弱病毒毒力。這和國外文獻報道結果不一致組3中豬接種103 TCID50的 ASFV SY18ΔMGF 後，次日開始有的豬出現體溫升高，持續1~3d,但均未超過41.3℃ ，隨後恢復正常，後期未見體溫異常，觀察期精神狀態正常，採食量未見異常；組4中豬接種104 TCID50的 ASFV SY18ΔMGF 後次日有的豬出現體溫升高，體溫範圍在 40.2~41.3℃ 之間，持續8~13日不等，隨後恢復正常，未見精神沉鬱或採食量減少等臨床症表現。組5、6中豬以103TCID50和104TCID50 劑 量 接 種 ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v後，只出現1~2d內體溫升高，體溫均在 40.5℃ 以下，隨後體溫恢復正常，採食量和精神狀態均未見異常。說明，MGF基因缺失可顯著降低 ASFV 毒力，與國外有關研究結果一致：在 MGF 基因缺失基礎上進一步缺失CD2v基因，可明顯降低單純缺失MGF基因的 ASFV 所引起的較長時間的發熱反應，安全性進一步提高。對觀察期內採集的血液、糞、唾液進行的 ASFV 核酸檢測結果表明，在血液、唾液中可偶爾檢測到病毒核酸，糞便中檢測結果陰性。

對組3、5、6中的5頭豬在免疫後28d，連同組7中5頭攻毒對照豬，以 ASFVSY18強毒株進行攻毒試驗，攻毒方式為口服，攻毒劑量為103TCID50，觀察35日。結果，組3、5、6中免疫豬均獲得完全保護，在觀察期內檢測體溫均在正常範圍內，未見任何異常臨床表現。對照組5只豬全部發病，42℃以上高燒持續2~7d 後全部死亡。結果說明，ASFVSY18ΔMGF/ΔCD2v不僅具有很好的安全性，而且具有良好的攻毒保護效果，可作為良好的ASF預防疫苗候選株。

ASF屬於OIE規定的必須通報的動物傳染病，中國將其歸類為一類傳染病。自 2018年8月初以來，中國31個省、市、區以及越南、蒙古、北韓、寮國都已向 OIE通報了 ASF疫情，流行形勢嚴峻。在目前控制 ASF傳染源、切斷傳播途徑、保護易感動物等生物安全措施均不能完全奏效情況下，研發安全有效的疫苗，保障生豬供應是中國生豬養殖刻不容緩亟需解決的問題。儘管疫苗的使用有可能縱容傳染源的存在、放鬆傳播途徑的切斷，甚至在很大程度上給 ASF根除帶來嚴重挑戰，但從保障國內生豬供應和解決國計民生角度考慮，在可控範圍內使用疫苗可能是目前在缺乏有效手段阻止 ASF 傳播情況下無奈且唯一有效的選擇。

本研究採用基因工程方法構建了缺失 ASFV毒力基因的缺失株，對其在動物體內的免疫效果和安全性進行了初步評價，顯示免疫 MGF 單基因和MGF、CD2v雙基因缺失的豬對 ASFV 強毒攻擊具有完全的保護作用，說明其可作為中國非洲豬瘟疫苗候選株，值得進一步研究和探索。目前全球範圍內，很多學者對非洲豬瘟疫苗的研發持懷疑甚至反對態度，這主要是因為 ASFV 不能誘導機體產生中和抗體，在豬體產生免疫保護的情況下，強毒依然可感染併產生病毒血症。研究證實，ASFV 自然弱毒株在試驗豬可造成嚴重的副作用，更有可能出現新的變異和新的流行。因此使用疫苗對於消除非洲豬瘟確實是不利的。進一步提高疫苗候選株的安全性和擴大疫苗效力的評價範圍以及更為長期的生物安全評價對於非洲豬瘟疫苗而言是十分必要的。

已經報道的 ASFV 毒力相關基因有多種，本研究只選擇了目前國際上報道較多的MGF 和CD2v基因作為缺失物件。我們的結果顯示，CD2v基因單獨缺失對病毒毒力影響有限，而 MGF基因(含3個 MGF505基因和3個 MGF360基因) 缺失後，高劑量免疫後儘管會引起較長時間的體溫升高，但是不影響機體的精神狀態和採食量。在低劑量免疫時，導致機體長時間發熱的現象消失。在MGF 缺失基礎上進一步缺失 CD2v基因後，病毒接種引起的長時間發熱現象基本消除，說明儘管CD2v單基因缺失株毒力很強，但 CD2v基因缺失能夠進一步降低MGF缺失株的毒力。

未來非洲豬瘟疫苗研究的重要方向

儘管我們構建的 ASFV 雙基因缺失疫苗具有很好的安全性和免疫保護效果，但由於 ASFV 結構複雜，病毒感染和免疫機制尚未完全明確，且 ASFV產生的抗體不具中和活性，因此ASFVSY18ΔMGF/ΔCD2v長期使用的安全性及免疫持續期有待進一步評價。從安全性的角度考慮，研究ASFV 亞單位疫苗、病毒載體疫苗等也將是未來非洲豬瘟疫苗研究的重要方向。

1:分離出中國第一株非洲豬瘟病毒。

2:創制了非洲豬瘟候選疫苗。

3:兩種候選疫苗株體外和體內遺傳穩定性強。

4:明確了最小保護接種劑量，證明大劑量和重複劑量接種安全。

5:臨床前中試產品工藝研究初步完成。