馬頭琴的兩根弦，有粗細之分（內細外粗）。粗弦為陽弦，一般由150根馬尾組成；細弦為陰弦，由120根馬尾組成。

馬頭琴的兩根弦通常是分別拉一根的，這主要用於演奏旋律。但也可以兩根一起拉，以便能產生和聲效果。（注意：馬頭琴的定弦和二胡等絃樂器不一樣，是裡弦比外弦高4度的。）

馬頭琴最廣泛使用的定弦法是反四度定弦法（與提琴高低音弦相反）。

外弦為低音，內弦為高音。

外弦低音5，內弦1。

定弦的絕對音高是：外弦小字組g，內弦為小字一組c1（也就是中央C）。

調絃方法：

1.馬頭琴兩根弦，左手側的琴絃即外弦，為中央g調；右手側的琴絃即內弦，為中央c調。上面有兩個軸，左邊的軸往後擰，右邊的往前擰。

2.聽音調絃，能夠用耳朵聽，辨認音色進行調絃會使演奏更加精妙。

3.不同的木材，弦，空間，發聲點等等不一樣都會讓音色有很大變化。

需要注意的是：

馬頭琴兩根弦。馬頭琴的定弦有多種，因較細的琴絃張在裡弦，較粗的弦張在外弦，所以常以反四度關係定弦為g、c1，有時也以正四度關係定弦為d1、a，正五度關係定弦為d1、g。