1661年（清順治十八年，永曆十五年），順治帝崩，皇三子康熙帝繼位；鄭氏降將黃梧向當權者鰲拜建議“平賊五策”，內容包括長達20年的遷界令，自山東至廣東沿海二十里，斷絕鄭成功的經貿財源；毀沿海船隻，寸板不許下水；同時斬成功之父鄭芝龍於寧古塔流徙處（一說斬於北京菜市口，即今府學衚衕西口，元代以來的刑場）；挖鄭氏祖墳；移駐投誠官兵，分墾荒地。

鄭成功接連聽聞噩耗，加上在臺將士水土不服人心惶惶，其子鄭經又在澎湖與乳母私通，使得鄭成功內外交逼，於1662年（清康熙元年，永曆十六年）五月初八急病而亡，死前大喊：“我無面目見先帝於地下”，抓破臉面而死，年僅39歲。然而根據夏琳《閩海紀要》和江日升《臺灣外志》的記載，鄭成功病情一開始並不嚴重，還能看書、觀臺、飲酒，有人認為可能是被下毒害死。

鄭成功有可能是被人投毒。1、死前狀況多是中毒跡象。2、夏琳《閩海紀聞》載鄭成功臨終前都督洪秉誠調藥以進，被成功投之於地，後鄭成功“頓足扶膺，大呼而殂”。3、鄭氏集團內部爭鬥不斷，而鄭成功此人也是非常暴力，很多親戚都被處分過。伍遠資所編《鄭成功傳說》中有對當時的清廷收買內奸刺殺他。