能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連線酶。該酶催化DNA相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA單鏈缺口封合起來。大腸桿菌和動植物細胞中都有DNA連線酶。為將限制性酶切片段共價地連線起來，可使用T4DNA連線酶，或大腸桿菌連線酶。T4DNA連線酶是分子量58kD的多肽，是T4噬體感染大腸桿菌而產生的。在連線反應中以ATP為輔助因子，是應用最廣的連線酶，有商品供應。它的用途是：①連線帶匹配粘端的DNA分子，②使平端的雙鏈DNA分子互相連線或合成的接頭相連線。大腸桿菌DNA連線酶能使互相匹配的5′突出端和3′突出端的雙鏈DNA連線，反應中以NAD+作為輔助因子，基因工程不常用。

DNA連線酶：DNA連線酶可在兩個寡核苷酸之間進行連線反應，同時必須與另一DNA鍊形成雜交體，相當於連線dsDNA中的缺口，反應在4565攝氏度條件下進行，需要NADsuperscript+superscript的參與。 一般用於檢測等位基因的變化和PCR擴增中是否引入寡核苷酸。