光緒帝是被慈禧太后毒殺的。

下毒時間是1908年11月10日（光緒三十四年十月十七日）傍晚5點鐘左右。

光緒皇帝在中毒當晚向內務府發出了兩道緊急召醫的手諭，但是內務府帶來的醫生當晚被阻攔在中南海宮門外，未能進入瀛臺為光緒帝診治。次日早晨西醫屈桂庭進入瀛臺，發現光緒帝腹痛難忍在床上打滾，且“面黑，舌黃黑”，並斷言此症狀“與前病絕少關係”。但是屈桂庭也未對此時中毒垂危的光緒帝進行任何救治，僅僅進言“以暖水熨敷腹部”便匆匆退出。此後，雖有其他御醫進入瀛臺為光緒帝診治，但是所開方藥無一味對症。1908年11月14日（光緒三十四年十月二十一日）晚6時33分左右，光緒帝去世。

在光緒帝喝下毒藥，尚未發作時，慈禧太后已經命人將皇帝梓宮停在乾清宮，預備發喪（慈禧太后估算光緒帝當晚即死，沒有想到光緒帝在中毒後仍然堅持了四天）。由此可以判定，下毒之人必為慈禧太后，因為其他人沒有調動皇帝梓宮的權力。

具體考證過程，請看國家清史委員會編纂的《清光緒帝死因鑑證》。