過程分兩階段：

①各種糖異生前體（除甘油外）轉變成磷酸烯醇式丙酮酸；

②磷酸烯醇式丙酮酸轉變為6-磷酸葡萄糖，再生成各種單糖或多糖。

從丙酮酸開始合成糖的過程雖然與糖酵解的逆反應類似，但是由於己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶所催化的三個反應很難逆向進行。在糖異生作用中，己糖激酶和磷酸果糖激酶催化的兩個反應的逆過程分別由葡萄糖-6-磷酸酶和果糖1，6-二磷酸酶催化完成。丙酮酸激酶催化的反應的逆過程，則透過丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成草醯乙酸，再由磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶催化生成磷酸烯醇式丙酮酸。糖異生調節飢餓時，體內脂肪及蛋白質分解加強，劇烈運動時肌肉糖酵解加強，均可提供較多的前體加速肝中的糖異生。

肝細胞ATP或乙醯輔酶A(CoA）供應充分時，能加強丙酮酸羧化而成糖。

腎上腺素、胰高血糖素、腎上腺皮質激素都能增加肝細胞中的糖異生；胰島素則抑制之。

生理意義空腹或飢餓時主要靠糖異生維持正常血糖濃度，以滿足腦組織等對葡萄糖持續消耗的需要，也充分利用了體內過多的非糖物質如乳酸、戊糖氨基酸等。