退火溫度為引物和模板結合時候的溫度引數，當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.它是影響PCR特異性的較重要因素。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。

在模板變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物複雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞，這就使PCR後期的過程成為可能。

退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可透過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許範圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高pcr反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。