梯度洗脫的優勢
等度分離是指在洗脫過程中流動相組成不變的分離方法；而梯度分離是指在洗脫過程中流動相的組成隨執行過程而變化的分離方法。梯度分離可以透過逐漸增加強溶劑的濃度，從而兼顧樣品的分離度及保留時間。
目前，梯度條件應用得比等度少很多，主要原因有以下幾點：
1. 一些實驗室尚不具備梯度洗脫裝置
2. 梯度洗脫更復雜，似乎更難進行新方法建立與常規分析
3. 某些檢測器，如示差檢測器不能使用梯度洗脫
4. 每次執行梯度洗脫後，需重新平衡色譜柱，耗時較長
5. 不同裝置的分離效果可能不同，所以梯度洗脫法移植時會出現差異
6. 梯度洗脫中的基線問題更為普遍，並且必須使用高純溶劑
梯度洗脫的應用範圍
1. 樣品組分複雜，K值分佈寬
2. 大分子樣品，尤其是生物樣品，如多肽的分離
3. 樣品中含有晚流出干擾物，它們會汙染色譜柱或在後續的執行中流出
分離度的最佳化
梯度洗脫方法的影響因素比較多，所以當採用一種標準方法進行梯度試驗的時候，會因為使用的系統的不同或色譜柱的不同，而使得目標峰的保留時間和分離效果有很大的差異
藥典方法，作為一種法定的方法，流動相的組成不能隨意變動。此時，實驗者可以調整的只有色譜柱的品牌和梯度比例或速率。一部分實驗者並不十分重視的色譜柱選擇，對於梯度方法是更為重要的。即使同樣的鍵合相，但生產廠家的不同或品牌的不同，其孔徑、比表面積等填料引數均有很大差異，對樣品的選擇性也會有很大的差異。從經驗來說，選擇一隻合適的色譜柱會更節約實驗中的人力和物力的消耗。您可以根據分離需要，諮詢色譜柱廠家，以獲得更專業的色譜柱推薦。確定色譜柱之後，如果需要對分離度進行調整，首先應該從保留時間較短的一對色譜峰的分離度開始調整，然後一對一對依次進行調整。梯度方法和等度方法改善樣品分離度的方法和思路是一致的。
注意事項
1． 基線漂移
當採用梯度洗脫時，流動相的純度不夠易導致基線明顯漂移。
2. 干擾峰
當進行空白梯度試驗時，尤其用短波長UV檢測和高靈敏度設定時，色譜圖中可能會出現很大的譜峰。這類干擾峰可能由流動相中含有的疏水性的並具有UV吸收的雜質引起，如水、有機溶劑或流動相新增劑。出現這樣的狀況可透過簡單的實驗查出汙染源。
查詢汙染源的*步是先用水相平衡柱30min，然後進行一次空白梯度。然後平衡5min後重復空白梯度。如*次執行的干擾峰大得多，可能是水汙染。如兩次空白執行無差異，有機溶劑的問題可能較大。流動相新增劑的可能汙染可透過重複不哈新增劑的空白梯度來檢測。當鑑別出流動相溶劑或組分被汙染後，必須用乾淨的試劑代替原試劑。
另外，如果梯度條件設定錯誤也容易導致干擾峰的出現。如線性梯度被設定為臺階梯度
4. 色譜峰保留不重複
由於實際樣品可能含有的強保留的雜質。如果梯度的zui終流動相組成僅為洗脫目標組分，則強保留的雜質可能會在色譜柱上發生聚集，因而會改變柱效和保留值。所以建議在梯度洗脫末尾時，保持強洗脫溶劑一段時間，以便清洗色譜柱，保證更好的重複性。
梯度洗脫中，在一次進樣結束後，應該用初始流動相平衡色譜柱一段時間後，再進行下一次實驗。如果不能徹底平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保留值和分離效果會發生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相（如4.6×150mm的色譜柱為7~15ml）。然而，這一平衡體積也會隨流動相和樣品而異，需要試驗人員對平衡體積進行試驗。
梯度洗脫的優勢
等度分離是指在洗脫過程中流動相組成不變的分離方法；而梯度分離是指在洗脫過程中流動相的組成隨執行過程而變化的分離方法。梯度分離可以透過逐漸增加強溶劑的濃度，從而兼顧樣品的分離度及保留時間。
目前，梯度條件應用得比等度少很多，主要原因有以下幾點：
1. 一些實驗室尚不具備梯度洗脫裝置
2. 梯度洗脫更復雜，似乎更難進行新方法建立與常規分析
3. 某些檢測器，如示差檢測器不能使用梯度洗脫
4. 每次執行梯度洗脫後，需重新平衡色譜柱，耗時較長
5. 不同裝置的分離效果可能不同，所以梯度洗脫法移植時會出現差異
6. 梯度洗脫中的基線問題更為普遍，並且必須使用高純溶劑
梯度洗脫的應用範圍
1. 樣品組分複雜，K值分佈寬
2. 大分子樣品，尤其是生物樣品，如多肽的分離
3. 樣品中含有晚流出干擾物，它們會汙染色譜柱或在後續的執行中流出
分離度的最佳化
梯度洗脫方法的影響因素比較多，所以當採用一種標準方法進行梯度試驗的時候，會因為使用的系統的不同或色譜柱的不同，而使得目標峰的保留時間和分離效果有很大的差異
藥典方法，作為一種法定的方法，流動相的組成不能隨意變動。此時，實驗者可以調整的只有色譜柱的品牌和梯度比例或速率。一部分實驗者並不十分重視的色譜柱選擇，對於梯度方法是更為重要的。即使同樣的鍵合相，但生產廠家的不同或品牌的不同，其孔徑、比表面積等填料引數均有很大差異，對樣品的選擇性也會有很大的差異。從經驗來說，選擇一隻合適的色譜柱會更節約實驗中的人力和物力的消耗。您可以根據分離需要，諮詢色譜柱廠家，以獲得更專業的色譜柱推薦。確定色譜柱之後，如果需要對分離度進行調整，首先應該從保留時間較短的一對色譜峰的分離度開始調整，然後一對一對依次進行調整。梯度方法和等度方法改善樣品分離度的方法和思路是一致的。
注意事項
1． 基線漂移
當採用梯度洗脫時，流動相的純度不夠易導致基線明顯漂移。
2. 干擾峰
當進行空白梯度試驗時，尤其用短波長UV檢測和高靈敏度設定時，色譜圖中可能會出現很大的譜峰。這類干擾峰可能由流動相中含有的疏水性的並具有UV吸收的雜質引起，如水、有機溶劑或流動相新增劑。出現這樣的狀況可透過簡單的實驗查出汙染源。
查詢汙染源的*步是先用水相平衡柱30min，然後進行一次空白梯度。然後平衡5min後重復空白梯度。如*次執行的干擾峰大得多，可能是水汙染。如兩次空白執行無差異，有機溶劑的問題可能較大。流動相新增劑的可能汙染可透過重複不哈新增劑的空白梯度來檢測。當鑑別出流動相溶劑或組分被汙染後，必須用乾淨的試劑代替原試劑。
另外，如果梯度條件設定錯誤也容易導致干擾峰的出現。如線性梯度被設定為臺階梯度
4. 色譜峰保留不重複
由於實際樣品可能含有的強保留的雜質。如果梯度的zui終流動相組成僅為洗脫目標組分，則強保留的雜質可能會在色譜柱上發生聚集，因而會改變柱效和保留值。所以建議在梯度洗脫末尾時，保持強洗脫溶劑一段時間，以便清洗色譜柱，保證更好的重複性。
梯度洗脫中，在一次進樣結束後，應該用初始流動相平衡色譜柱一段時間後，再進行下一次實驗。如果不能徹底平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保留值和分離效果會發生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相（如4.6×150mm的色譜柱為7~15ml）。然而，這一平衡體積也會隨流動相和樣品而異，需要試驗人員對平衡體積進行試驗。