乳鐵蛋白(L a c t o F e r r n，以下簡稱為L F)是一種具有多種生物學功能的鐵離子結合糖蛋白，主要存在於哺乳動物的乳汁當中。19 5 9年G r o v e s從牛乳中分離獲得。L F在牛初乳中含量較高，約為1 g/L,母乳中的含量約為牛乳中的10倍。研究表明L F具有多種生物活性：能促進鐵的吸收、廣譜抗菌性、抑制遊離基的形成、提提高免疫能力等。
目前常用的檢測L F的方法主要有免疫擴散法、高效液相色譜法和電泳法。
免疫擴散法操作簡單、快速，但只適用於L F含量較高時的檢測，能能快速測定LF,但檢測新增乳鐵蛋白的配方奶粉時，因奶粉本身所含有的元素非常多必須進行前處理，而前處理過程往往會干擾到其中的L F；電泳法操作麻煩，而且不適於大量樣品的檢測。本文所建立的是利用酶聯免疫反應的E L I S A法，操作方便、測出限靈敏、且能一次性定性定量檢測較多數量的樣品，是一種理想的L F檢測方法。
1材料和方法
1.1試劑和儀器包被緩衝液(0.0 5 M碳酸鹽一重碳酸鹽，p H 9.6)；洗液(5 0田mo l N a C 1,0. 0 5 % T 2 0, p H 9. 6 ) ; 封閉液 ( 5 0mmol/LTr I s, 0. 14 m o 1 / L N a C 1, 1%BSA, pH8. 0 ) ; 樣品廣共軛稀釋液(5 0mo 1/L T r I s, 0. 14 m ol / L N a酶底物(TMB底物，溶液B)；中止液H 2S04(2so4/L,上海化學試劑公司)；純化山羊抗牛親合乳鐵蛋白(lmg/mL,S I g ma)；牛源乳鐵蛋白準品(lm g/mL,S I gma)；山羊抗牛乳鐵蛋白一H R P共軛物(lmg mL,S I gma)；酶聯檢測儀( B I o-R A D, M o d e 15 5 0)；酶標板(9 6孔，N u n c)；微量進樣器(e p p e n d or f, 10 H L, 2 0 0(市購)。口L,1000pL,5mL)；嬰兒配方奶粉收稿日期：2 0 0 8-01-1 2基金專案：國家"十一五"科技支撐計劃(2 006BAD04A1 4 ) 。
1.2.2在每孔中注入2 0 0口L封閉液，孵育3 0mi n後洗板3次。(空白樣)、乳鐵蛋白1.2. 3在酶標板中加入對照樣標樣稀釋液和2個待測樣溶液，孵育6 0mi n後洗板5次。L F準溶由L F準品配製成分別為0 7. 815. 6 2 5 31. 2 562. 5125250500 5 0 0 n 9 lm L. 2 5 0 n g L. 15. 6 2 5 n 9lmL 和 7. 8n g/mL的溶液。
待測樣I為市購嬰兒配方奶粉，其乳鐵白含量為3 0-60mg 10 0 g，稱取1 0 g配成1 Om L的溶液，再將溶液稀釋1倍成待測容液I；待測樣其中：A 1為對照樣，B 1-H 1分別為濃度為II.II I.IV為L F標準品配製的含量為3 0 n g/mL、6 O n 9lm L. 9 0 n 9lm L 的待測液。1.2.4酶標板每孔中注入1 00 L L F一H R P共軛物，孵育6 0mi n後洗板5次。L F一H R P共軛物用稀釋液以1:10 0 0 0 0 0稀釋。
嬰兒的免疫系統約在一歲後才發育成熟，一歲內母乳餵養的嬰兒可從母乳中獲得豐富的活性免疫物質以提供保護。近幾年嬰兒配方奶粉的營養成分和產品質量，越來越受到廣泛關注，因為對於人工餵養的嬰兒來說，他們的部分甚至全部營養來自奶粉，所以奶粉的營養成分和質量就顯得格外重要。母乳是嬰兒營養的最好來源。因此母乳是配方奶粉的最佳參照標準。一些活性物質成份，如乳鐵蛋白、免疫球蛋白和核苷酸等，在母乳中存在而普通配方奶粉中含量基微。中國現在也對新增乳鐵蛋白嬰兒配方奶粉進行了開發和研究，本文討論的是一種嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法。
乳鐵蛋白(L a c t o F e r r n，以下簡稱為L F)是一種具有多種生物學功能的鐵離子結合糖蛋白，主要存在於哺乳動物的乳汁當中。19 5 9年G r o v e s從牛乳中分離獲得。L F在牛初乳中含量較高，約為1 g/L,母乳中的含量約為牛乳中的10倍。研究表明L F具有多種生物活性：能促進鐵的吸收、廣譜抗菌性、抑制遊離基的形成、提提高免疫能力等。
目前常用的檢測L F的方法主要有免疫擴散法、高效液相色譜法和電泳法。
免疫擴散法操作簡單、快速，但只適用於L F含量較高時的檢測，能能快速測定LF,但檢測新增乳鐵蛋白的配方奶粉時，因奶粉本身所含有的元素非常多必須進行前處理，而前處理過程往往會干擾到其中的L F；電泳法操作麻煩，而且不適於大量樣品的檢測。本文所建立的是利用酶聯免疫反應的E L I S A法，操作方便、測出限靈敏、且能一次性定性定量檢測較多數量的樣品，是一種理想的L F檢測方法。
1材料和方法
1.1試劑和儀器包被緩衝液(0.0 5 M碳酸鹽一重碳酸鹽，p H 9.6)；洗液(5 0田mo l N a C 1,0. 0 5 % T 2 0, p H 9. 6 ) ; 封閉液 ( 5 0mmol/LTr I s, 0. 14 m o 1 / L N a C 1, 1%BSA, pH8. 0 ) ; 樣品廣共軛稀釋液(5 0mo 1/L T r I s, 0. 14 m ol / L N a酶底物(TMB底物，溶液B)；中止液H 2S04(2so4/L,上海化學試劑公司)；純化山羊抗牛親合乳鐵蛋白(lmg/mL,S I g ma)；牛源乳鐵蛋白準品(lm g/mL,S I gma)；山羊抗牛乳鐵蛋白一H R P共軛物(lmg mL,S I gma)；酶聯檢測儀( B I o-R A D, M o d e 15 5 0)；酶標板(9 6孔，N u n c)；微量進樣器(e p p e n d or f, 10 H L, 2 0 0(市購)。口L,1000pL,5mL)；嬰兒配方奶粉收稿日期：2 0 0 8-01-1 2基金專案：國家"十一五"科技支撐計劃(2 006BAD04A1 4 ) 。
1.2實驗方法
1.2.1確定酶標板的數量，將包被抗體用包被緩衝12 2杜凌等：嬰兒奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法的研究收值讀數，計數如下。表對應濃度(·/ngmL一1)液稀釋(1:100)後，立即在每孔中注入1 0 0p L包被稀釋液，室溫下孵育6 0mi n後，洗板3次。410 nm時的光吸值讀數。
1
A B C D E F G H
0. 0 0 0 0. 0410. 0 8 20. 2430. 3740. 638 1. 0 8 91. 8 3 0
2-0. 0 0 4 0. 0 4 2 0. 0970. 1930. 3910. 6 3 71. 1511. 8 0 0
3-0. 0010. 0 3 4 0. 0880. 2110. 4470. 6 4 21. 0 6 01. 8 2 3
1.2.2在每孔中注入2 0 0口L封閉液，孵育3 0mi n後洗板3次。(空白樣)、乳鐵蛋白1.2. 3在酶標板中加入對照樣標樣稀釋液和2個待測樣溶液，孵育6 0mi n後洗板5次。L F準溶由L F準品配製成分別為0 7. 815. 6 2 5 31. 2 562. 5125250500 5 0 0 n 9 lm L. 2 5 0 n g L. 15. 6 2 5 n 9lmL 和 7. 8n g/mL的溶液。
待測樣I為市購嬰兒配方奶粉，其乳鐵白含量為3 0-60mg 10 0 g，稱取1 0 g配成1 Om L的溶液，再將溶液稀釋1倍成待測容液I；待測樣其中：A 1為對照樣，B 1-H 1分別為濃度為II.II I.IV為L F標準品配製的含量為3 0 n g/mL、6 O n 9lm L. 9 0 n 9lm L 的待測液。1.2.4酶標板每孔中注入1 00 L L F一H R P共軛物，孵育6 0mi n後洗板5次。L F一H R P共軛物用稀釋液以1:10 0 0 0 0 0稀釋。
表2
吸收值平均讀數對應的L F濃度(n g/mL)待測樣讀數待測樣的平均讀數一0.0 0 2 0待測樣I 0. 0 4 7. 8 0. 3 2 4 0.08915.6 2 5待測樣I I0. 21631. 2 5 0. 2 1 1 I 0.4 0 4 6 2.5待測樣I I 0. 6391250. 3 8 6 1.12 5 0待測樣I V 1. 8185000. 5 3 7
根據A一H和計數制定標準曲線圖(如圖1)，得多項式y一8 8. 104×2+118. 46×+1. 09 2 2,y為L F的含量，x為吸收值，R 2值為9 9.9 8%。根據待測樣的讀數，可求得待測樣I的L F含量為4 8.7 6 n g/m L,待測樣II的L F含量為3 0.0 6 n g/mL,待測樣III的稀釋至測限範圍內檢測。抗原如在4℃條件下包被過夜會更加穩定包被或反應的時間不同等因2 2.2因操作者不同、素均會影響最終結果，因此每次檢測都需重新制訂標準曲線，LF含量為5 9.9 4 n g/"m L,待測樣I V的L F含量為9 0.11ng/ml。
2.2.3嬰兒配方奶粉因其元素較多，干擾因素也較多，因此在檢測時現配現檢，同時注意稀釋比例。LF含量(/n g田L一1)參考文獻L1 1顧瑞霞，駱承庠，乳與乳製品的生理功能特性LW]，中國輕工業出版社，2 0 0 0. L2 1張英華，酶聯免疫法測定牛初乳中乳鐵蛋白的含量L J 1，中國乳品工業19 9 7 2 7。
2.2.1經實驗驗證，在檢測限7.8-50 0 n g/m L之間反應快速靈敏。如L F濃度過高時，蛋白質分子間相互作用力較大，可能會影響載體對蛋白質的吸附；如濃度過小，酶標板反應表面可能不能包被完全，也會對反應過程有影響。因此，建議待測樣品。