將100 g蘋果迅速去梗和核後切成小塊，和400mL左右預先冷凍至－26℃的丙酮一起倒入組織搗碎機中均質（20,000 rpm，2 min），然後迅速抽濾，保留濾紙上的沉澱部分，將沉澱薄層中殘留的丙酮用冷風吹去，至沉澱無丙酮味。將所得丙酮粉轉移至150 mL 0.05mol/L磷酸鹽緩衝液（pH 6.5）中，攪拌30 min，然後離心（4℃,10000 r/m,20 min），離心所得上清液如有混濁，則用8層紗布過濾，從而得到多酚氧化酶提取液。
2、不同pH下多酚氧化酶活力的測定
在比色皿中分別加入1.8~1.1 mL pH為3.6的緩衝液和0.7mL兒茶酚溶液，攪勻後加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速攪勻，測定反應混合物在400 nm下的吸光值隨時間的變化，參比以緩衝液代替酶液。依次測定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0幾個pH。
青蘋果 3.9
晚熟蘋果 3.47
蘋果汁 3.4 - 4.0
蘋果醬 3.3 - 3.6
金蛇果 3.6
喬納森 蘋果 3.33
麥金託什蘋果 3.34
至於氧化後蘋果中多酚氧化酶最適 pH 的測定
1、實驗原理
存在於果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在適宜的條件下能引起果蔬的酶促褐變。因此，多酚氧化酶對於食品加工具有重要意義。多酚氧化酶是一種含銅離子的酶，它能催化兩類不同的反應。一是一元酚羥基化，二是鄰-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同時催化這兩類反應；而在另一些植物中，多酚氧化酶僅能催化鄰-二酚氧化，卻不能催化一元酚羥基化。如果採用鄰-二酚作底物，那麼隨著酶催化反應進行，反應混合物的吸光值因鄰-苯醌的量的增加而增大，因此可採用分光光度法測定多酚氧化酶的活力。
2、試劑和儀器
試劑：0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH分別為3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L磷酸鹽緩衝液，pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L兒茶酚溶液、0.05mol/L磷酸鹽緩衝液，pH=6.5、丙酮
儀器：組織搗碎機、抽濾裝置、721分光光度計（含比色皿）、秒錶、常規玻璃儀器、離心機
三、實驗步驟
1、從蘋果中萃取多酚氧化酶
將100 g蘋果迅速去梗和核後切成小塊，和400mL左右預先冷凍至－26℃的丙酮一起倒入組織搗碎機中均質（20,000 rpm，2 min），然後迅速抽濾，保留濾紙上的沉澱部分，將沉澱薄層中殘留的丙酮用冷風吹去，至沉澱無丙酮味。將所得丙酮粉轉移至150 mL 0.05mol/L磷酸鹽緩衝液（pH 6.5）中，攪拌30 min，然後離心（4℃,10000 r/m,20 min），離心所得上清液如有混濁，則用8層紗布過濾，從而得到多酚氧化酶提取液。
2、不同pH下多酚氧化酶活力的測定
在比色皿中分別加入1.8~1.1 mL pH為3.6的緩衝液和0.7mL兒茶酚溶液，攪勻後加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速攪勻，測定反應混合物在400 nm下的吸光值隨時間的變化，參比以緩衝液代替酶液。依次測定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0幾個pH。
四、資料記錄與處理
資料記錄：
pH值
3.6
4.0
4.6
5.0
5.6
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
加酶量（mL）
1.0
1.2
10´OD值
0.172
0.166
（12s）
0.160
0.150
0.147
（12s）
0.115
（12s）
0.106
（15s）
0.130
（11s）
0.160
（11s）
0.151
20´OD值
0.214
0.204
0.210
0.194
0.149
0.115
0.107
0.132
0.162
0.151
30´OD值
0.258
0.250
0.258
0.240
0.152
0.115
0.109
0.134
0.163
0.151
40´OD值
0.300
0.295
0.302
0.296
0.156
0.117
0.108
0.135
0.165
0.152
50´OD值
0.341
0.338
0.348
0.329
0.161
0.117
0.110
0.136
0.166
0.153
60´OD值
0.382
0.377
0.392
0.373
0.166
0.118
0.111
0.137
0.170
0.154
70´OD值
0.420
0.418
0.433
0.415
0.171
0.121
0.113
0.139
0.173
0.156
80´OD值
0.457
0.456
0.475
0.455
0.175
0.123
0.117
0.143
0.175
0.158
90´OD值
0.494
0.494
0.514
0.496
0.179
0.126
0.118
0.143
0.178
0.161
100´OD值
0.529
0.530
0.554
0.534
0.186
0.127
0.120
0.145
0.182
0.164
110´OD值
0.565
0.567
0.591
0.572
0.188
0.130
0.121
0.151
0.184
0.165
120´OD值
0.598
0.601
0.626
0.607
0.192
0.133
0.124
0.151
0.188
0.168
用Excel處理資料，得到不同pH下消光-時間曲線的斜率，斜率的物理意義即每分鐘增加的消光值，也即酶的活力單位數。
資料處理：
pH值
3.6
4.0
4.6
5.0
5.6
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
加酶量
1.0mL
1.2mL
酶活力
0.2328
0.2410
0.2540
0.2498
0.0264
0.0102
0.0102
0.0114
0.0155
0.0098
酶活mL
0.2328
0.2410
0.2540
0.2498
0.022
0.0085
0.0085
0.0095
0.0129
0.0082
用Excel作圖得到下圖：
由酶活力-pH曲線關係可以得知蘋果中的多酚氧化酶在pH=4.6時的酶活力最高，也就是說pH4.6是蘋果中多酚氧化酶的最適pH。
1、蘋果中存在著多酚氧化酶的天然底物，因此在製備多酚氧化酶提取液的過程中，快速和低溫是必要的條件，否則將得到褐色的酶液。
2、丙酮可使酶蛋白沉澱下來，從而與天然底物分離，但是常溫下丙酮會導致酶變性，因此必須先冷卻至－26℃。事實上，在試驗中，丙酮並沒有冷卻到－26℃，因此勻漿時現取現用。
3、本實驗所測酶活較低，可能有兩個原因，一是所選的兩個蘋果有一個是紅蘋果不是酶活相對高點的青蘋果；二是在通風櫥裡用吹風機吹去丙酮時，所吹的風不是冷風，二是帶有溫度的熱風，導致酶有些許的失活所致。