《貓和老鼠》主要人物包括：湯姆（貓）、傑瑞（鼠）、兩隻鞋太太（人）、泰菲（鼠）、布奇（貓）等。

1、湯姆（貓）

總是閃著機會主義的光芒，弓著腰在一旁等待機會出擊傑瑞。在動畫片中，它總有一種強烈的慾望，總想抓住與它同居一室卻難以抓住的老鼠傑瑞。但總是遭到失敗。

2、傑瑞（鼠）

總是用挑逗的眼神看著鏡頭，並且常常在不經意期間玩弄湯姆。因為傑瑞古靈精怪，所以經常能成功的戲弄湯姆且讓他糗事百出，不過有時他也會被湯姆戲弄，時而在戲弄湯姆的同時也會享受到湯姆對它的關心，讓它感動。

3、兩隻鞋太太（人）

動畫中湯姆貓的幾種不同主人中最常出現的一位，經常處理兩位主角在自己家中所製造的麻煩。由於視角問題，鏡頭只能看到她腰以下的部位。在動畫中的設定大約40歲左右，身材粗壯的大媽形象。1952年之後不再登場。

4、泰菲（鼠）