革蘭染色法是最常用的染色方法，染色原理目前還不完全明確，主要有以下幾種學說:1.滲透學說:細菌細胞壁結構和化學組分上的差異是導致染色反應不同的主要原因。

2.化學學說:革蘭陽性菌菌體內含有大量核糖核酸鎂鹽，可以進入菌體內的結晶紫和碘牢固結合形成大分子複合物，此複合物不易被95%乙醇脫色。

革蘭陰性菌菌體核心糖核酸鎂鹽少，易在乙醇中脫去顏色。

3.等電點學說:革蘭陽性率等電點為pH2～3，革蘭陰性菌pH4~5，在同一pH條件下，革蘭陽性菌所帶電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷的鹼性染料結合更加牢固，不易脫色。

在細菌染色過程中，固定的操作是快速將載玻片透過火焰2-3次，其目的是讓細菌細胞膜貼玻片部分區域性蛋白質變性，從而固定於載玻片上而不易被染液或水沖掉。若玻片上的菌膜未能幹燥，則2-3次火焰的固定作用就會很差，細菌極易被染液或水沖掉。所以固定操作一定是在玻片乾燥之後再進行的步驟。

之所以不能利用火焰烘烤進行固定操作，是因為如果菌膜受熱時間過長，輕則細胞壁變性，使染色結果出現嚴重偏差；重則細菌死亡，菌體形態發生重大變化，最終導致染色失敗與結果誤判。