1. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,任何型別或等級的瓊脂糖都可以使用.我們強烈的建議您使用新鮮的TAE Buffer作為電泳緩衝液.不要重複使用電泳緩衝液,因為會因其PH的升高而減少產量.新鮮的TBE也可以用,但只能得到較低的產量.
2. 當所需DNA片段完全分離時,轉移凝膠至紫外燈上,儘可能快地把所需的DNA片段切下來. 注:切膠時儘量把多餘的凝膠切去,DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒.
3. 將帶有目的片段的凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中,稱重得出凝膠塊的重量.近似地確定其體積.假設其密度為1g/ml(幾乎所有DNA凝膠的密度都可以近似為1g/ml),於是凝膠塊的體積便可透過如下方法得到:凝膠薄片的重量為0.2g, 則其體積為 0.2 ml.加入等體積的Binding Buffer(XP2),於55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化,每2-3 min振盪或渦旋混合物. 重要提醒:在凝膠完全溶解之後,注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值.如果其pH值大於8的話,DNA的產量將大大減少.觀察混和物的顏色,如果是橙色或紅色,則要加入5 ul 濃度為5 M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值.經過這一調節,該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色.
4. 取一個乾淨的HiBind DNA Mini柱子裝在一個乾淨的2ml收集管內(已備好).
5. 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中.室溫下10,000 x g離心1分鐘.棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.
6. 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,一次只能轉移700ul至柱子中,餘下的可繼續重複第5步至所有的溶液都經過柱子.每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25gDNA的吸附能力.如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱子中.
7. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.移300ul Binding Buffer(XP2)至柱子中,室溫下, 10,000 x g下離心1min.
8. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.移700ul SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中.室溫下10,000xg離心1min. 注意:濃縮的SPW Wash Buffer 在使用之前必須按標籤的提示用乙醇稀釋.如果DNA 洗滌緩衝液在使用之前是置於冰箱中的,須將其拿出置於室溫下.
9. 重複用700ul SPW Wash buffer洗滌柱子.室溫下10,000xg離心1min.
10. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.室溫下,13,000 x g離心2 min以甩幹柱子基質殘餘的液體.
11. 把柱子裝在一個乾淨的1.5ml離心管上,加入15~30ul(具體取決於預期的終產物濃度)的Elution Buffer(或TE緩衝液)到柱基質上,室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA. 第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA. 如果再洗脫一次的話,可以把殘餘的DNA洗脫出來,不過那樣的濃度就會較低.
1. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,任何型別或等級的瓊脂糖都可以使用.我們強烈的建議您使用新鮮的TAE Buffer作為電泳緩衝液.不要重複使用電泳緩衝液,因為會因其PH的升高而減少產量.新鮮的TBE也可以用,但只能得到較低的產量.
2. 當所需DNA片段完全分離時,轉移凝膠至紫外燈上,儘可能快地把所需的DNA片段切下來. 注:切膠時儘量把多餘的凝膠切去,DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒.
3. 將帶有目的片段的凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中,稱重得出凝膠塊的重量.近似地確定其體積.假設其密度為1g/ml(幾乎所有DNA凝膠的密度都可以近似為1g/ml),於是凝膠塊的體積便可透過如下方法得到:凝膠薄片的重量為0.2g, 則其體積為 0.2 ml.加入等體積的Binding Buffer(XP2),於55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化,每2-3 min振盪或渦旋混合物. 重要提醒:在凝膠完全溶解之後,注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值.如果其pH值大於8的話,DNA的產量將大大減少.觀察混和物的顏色,如果是橙色或紅色,則要加入5 ul 濃度為5 M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值.經過這一調節,該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色.
4. 取一個乾淨的HiBind DNA Mini柱子裝在一個乾淨的2ml收集管內(已備好).
5. 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中.室溫下10,000 x g離心1分鐘.棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.
6. 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,一次只能轉移700ul至柱子中,餘下的可繼續重複第5步至所有的溶液都經過柱子.每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25gDNA的吸附能力.如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱子中.
7. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.移300ul Binding Buffer(XP2)至柱子中,室溫下, 10,000 x g下離心1min.
8. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.移700ul SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中.室溫下10,000xg離心1min. 注意:濃縮的SPW Wash Buffer 在使用之前必須按標籤的提示用乙醇稀釋.如果DNA 洗滌緩衝液在使用之前是置於冰箱中的,須將其拿出置於室溫下.
9. 重複用700ul SPW Wash buffer洗滌柱子.室溫下10,000xg離心1min.
10. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內.室溫下,13,000 x g離心2 min以甩幹柱子基質殘餘的液體.
11. 把柱子裝在一個乾淨的1.5ml離心管上,加入15~30ul(具體取決於預期的終產物濃度)的Elution Buffer(或TE緩衝液)到柱基質上,室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA. 第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA. 如果再洗脫一次的話,可以把殘餘的DNA洗脫出來,不過那樣的濃度就會較低.