DNA連線酶主要是連線DNA片段之間的磷酸二酯鍵最初從原核生物（大腸桿菌）分離得到的。現在生物基因工程主要是從T4噬菌體中分離得到的，一些病毒，中都有DNA連線酶。

DNA 連線酶是生物體內重要的酶，其所催化的反應在DNA的複製和修復過程中起著重要的作用。DNA連線酶分為兩大類:一類是利用ATP 的能量催化兩個核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴ATP的DNA 連線酶，另一類是利用煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化兩個核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴NAD* 的DNA 連線酶。

能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連線酶。該酶催化DNA相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA單鏈缺口封合起來。大腸桿菌和動植物細胞中都有DNA連線酶。為將限制性酶切片段共價地連線起來，可使用T4DNA連線酶，或大腸桿菌連線酶。T4DNA連線酶是分子量58kD的多肽，是T4噬體感染大腸桿菌而產生的。在連線反應中以ATP為輔助因子，是應用最廣的連線酶，有商品供應。它的用途是：①連線帶匹配粘端的DNA分子，②使平端的雙鏈DNA分子互相連線或合成的接頭相連線。大腸桿菌DNA連線酶能使互相匹配的5′突出端和3′突出端的雙鏈DNA連線，反應中以NAD+作為輔助因子，基因工程不常用。