苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的鹼性條件下對蛋白質或多肽進行處理,PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應,形成苯氨基硫甲醯(PTC)衍生物,即PTC-肽。
然後PTC-肽用三氟乙酸處理,N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷,釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。
接下來將該衍生物用有機溶劑(例如氯丁烷)從反應液中萃取出來,而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。
萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定,經酸作用,再進一步環化,形成一個穩定的苯乙內醯硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。
優點
①可與一級和二級氨基酸同時反應;
②衍生產物單一、穩定,凍乾的衍生物一20℃可貯存1個月,4℃水溶液中可貯存3 d,而色譜響應值無明顯變化;
③分析時間短,測定水解氨基酸僅需12 min。
缺點
①樣品的製備較為繁瑣,需預先去除剩餘試劑,而且雖然嚴格操作,但存在於樣品中的痕量PITC試劑也會縮短分析柱的壽命;
②胱氨酸的線性不好,實踐中此法不適用於遊離胱氨酸的測定;
③由於只能使用紫外檢測,所以和使用熒光檢測的方法相比,此法檢測靈敏度較低。
苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的鹼性條件下對蛋白質或多肽進行處理,PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應,形成苯氨基硫甲醯(PTC)衍生物,即PTC-肽。
然後PTC-肽用三氟乙酸處理,N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷,釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。
接下來將該衍生物用有機溶劑(例如氯丁烷)從反應液中萃取出來,而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。
萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定,經酸作用,再進一步環化,形成一個穩定的苯乙內醯硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。
優點
①可與一級和二級氨基酸同時反應;
②衍生產物單一、穩定,凍乾的衍生物一20℃可貯存1個月,4℃水溶液中可貯存3 d,而色譜響應值無明顯變化;
③分析時間短,測定水解氨基酸僅需12 min。
缺點
①樣品的製備較為繁瑣,需預先去除剩餘試劑,而且雖然嚴格操作,但存在於樣品中的痕量PITC試劑也會縮短分析柱的壽命;
②胱氨酸的線性不好,實踐中此法不適用於遊離胱氨酸的測定;
③由於只能使用紫外檢測,所以和使用熒光檢測的方法相比,此法檢測靈敏度較低。