細胞中的RNA主要有三類:rRNA約佔80%-85%,tRNA和核內小分子RNA約佔10%-15%,mRNA約佔1%-5%,由於rRNA佔絕大多數,因此我們用瓊脂糖凝膠電泳可以看到的即是rRNA,它也有三種類型:28S,18S,5S。所以我們看到的也應該是三條帶,而且28S的亮度為18S的兩倍。這樣的RNA才可以用來建庫。
在RNA的提取時,一定要注意RNase的汙染,因RNA極易被RNase的降解,操作時應儘量少說話,並在潔淨的環境中操作,主要防止手、唾液和空氣中Rnase的汙染;另一方面使用的所有玻璃儀器、移液器、吸頭和離心管都用0.5%DEPC溶液處理過夜,然後高壓滅菌15分鐘.但對於滅菌的一次性使用的塑膠製品基本上無RNase,,可以不經處理直接用於提取RNA,實驗室用的普通玻璃器皿和塑膠製品經常有Rnase汙染,使用前必須180度幹烤8小時或更長時間(玻璃器皿)或用氯仿沖洗(塑膠製品),另外,由於材料不同,機體內含有的糖、酚類物質不一樣,因此材料不同用的方法也應該不一樣。
下面是兩種提取方法,第一種適用於嫩組織或動物組織的總RNA的提取,第二種適用於老組織的提取。
試劑:提取緩衝液,KAc(5M), 異丙醇,無水乙醇,DEPC水
儀器:離心機,恆溫水浴鍋,研缽
方法一 動物、植物(嫩葉)的總RNA分離
大約2克植物組織或動物組織用液氮研磨
↓
加5mlTrizol裂解液
12000rpm ,4度,10分鐘
加入1ml氯仿
劇烈振盪15秒,室溫溫育2-3分鐘
室溫離心10分鐘,8000rpm
取上清,加入等體積的異丙醇,15-30度放置10分鐘。
12000g離心10分鐘
棄上清,加入10ml75%灑精洗沉澱。
2-8度下,不超過7500g離心5分鐘
棄上清,乾燥沉澱10分鐘
用DEPC水溶。
方法二 、植物老葉、老根或多糖含量高的材料的總RNA分離
1g組織液氮研磨,加入6ML提取緩衝液
2min振盪
65℃,20min
加入1.5MLKAc
混勻,冰浴20min
8000rpm,4℃,15min
取上清,加入0.6倍異丙醇,-20℃,1小時(或室溫15-20min)
12000rpm,4℃,15min
75%乙醇,12000rpm,20℃,5min
晾乾,溶60ulDEPC水,15min
12000rpm,4℃,5min, 上清即為RNA。
細胞中的RNA主要有三類:rRNA約佔80%-85%,tRNA和核內小分子RNA約佔10%-15%,mRNA約佔1%-5%,由於rRNA佔絕大多數,因此我們用瓊脂糖凝膠電泳可以看到的即是rRNA,它也有三種類型:28S,18S,5S。所以我們看到的也應該是三條帶,而且28S的亮度為18S的兩倍。這樣的RNA才可以用來建庫。
在RNA的提取時,一定要注意RNase的汙染,因RNA極易被RNase的降解,操作時應儘量少說話,並在潔淨的環境中操作,主要防止手、唾液和空氣中Rnase的汙染;另一方面使用的所有玻璃儀器、移液器、吸頭和離心管都用0.5%DEPC溶液處理過夜,然後高壓滅菌15分鐘.但對於滅菌的一次性使用的塑膠製品基本上無RNase,,可以不經處理直接用於提取RNA,實驗室用的普通玻璃器皿和塑膠製品經常有Rnase汙染,使用前必須180度幹烤8小時或更長時間(玻璃器皿)或用氯仿沖洗(塑膠製品),另外,由於材料不同,機體內含有的糖、酚類物質不一樣,因此材料不同用的方法也應該不一樣。
下面是兩種提取方法,第一種適用於嫩組織或動物組織的總RNA的提取,第二種適用於老組織的提取。
試劑:提取緩衝液,KAc(5M), 異丙醇,無水乙醇,DEPC水
儀器:離心機,恆溫水浴鍋,研缽
方法一 動物、植物(嫩葉)的總RNA分離
大約2克植物組織或動物組織用液氮研磨
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加5mlTrizol裂解液
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12000rpm ,4度,10分鐘
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加入1ml氯仿
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劇烈振盪15秒,室溫溫育2-3分鐘
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室溫離心10分鐘,8000rpm
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取上清,加入等體積的異丙醇,15-30度放置10分鐘。
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12000g離心10分鐘
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棄上清,加入10ml75%灑精洗沉澱。
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2-8度下,不超過7500g離心5分鐘
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棄上清,乾燥沉澱10分鐘
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用DEPC水溶。
方法二 、植物老葉、老根或多糖含量高的材料的總RNA分離
1g組織液氮研磨,加入6ML提取緩衝液
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2min振盪
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65℃,20min
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加入1.5MLKAc
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混勻,冰浴20min
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8000rpm,4℃,15min
取上清,加入0.6倍異丙醇,-20℃,1小時(或室溫15-20min)
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12000rpm,4℃,15min
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75%乙醇,12000rpm,20℃,5min
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晾乾,溶60ulDEPC水,15min
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12000rpm,4℃,5min, 上清即為RNA。