細胞凍存的步驟：

　　1、選擇活力好，密度約80%的細胞，此時細胞處於對數生長期，比較適合凍存。細胞凍存依舊分為貼壁細胞凍存和懸浮細胞凍存。

　　2、顯微鏡下觀察細胞狀態,若細胞密度較高，培養基變黃，需要換液4h之後再進行凍存操作，細胞長滿後，將培養皿中的培養基用槍小心的吸去。再用PBS沖洗一到兩次,儘量吸乾淨潤洗的PBS，加入胰酶消化細胞,消化一定要注意控制胰酶作用時間，消化細胞時由於每個細胞貼壁性不一樣，消化時間差別會很大,胰酶消化是需要比較精細的操作，既要充分消化下細胞打散成單細胞懸液，均勻接種，又要避免消化過度造成細胞嚴重受損。大家用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，所以不能完全規定消化時間，一般儀個人經驗為準。

　　對於消化這步，建議按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫後加入細胞，放入37℃培養箱，然後每隔30秒，吹打下細胞，如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，之後混勻細胞時儘量輕柔，不要產生過多氣泡。如果30秒不能分散，則再等30秒重複操作。

　　3、消化完成後加6-8ML完全培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液。

　　4、900-1000rpm離心3分鐘，棄上清,加入配製好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml,在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者,裝有細胞的凍存管放入-4℃冰箱10分鐘 ，然後放入-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

　　5、24小時後取出一隻凍存管復甦，檢查活性及是否汙染。

1. 配製含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；

2. 取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養皿表面）把單層生長的細胞消化下來；

4. 離心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入適量配製好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

6. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；

8. 凍存：標準的凍存程式為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然後放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

細胞凍存管融化

1.將細胞凍存管取出，浸入37℃水浴鍋內，輕輕晃動，注意融化，當融得只剩一個小冰塊時，將細胞插入冰中。

2.加入4℃預冷的培養基，用手指輕彈懸浮細胞團。

3.250g離心10min，去除上清液，再加入培養基，輕輕懸浮。

4.儘量將細胞中的DMSO洗去，計數。

在細胞凍存過程中，所結的冰晶對細胞傷害較大，所以過程一定要慢，DMSO能減少冰晶傷害。在細胞復甦過程中，要快，以減少融化對細胞的傷害，其實還是冰晶的問題。DMSO浸潤的細胞非常脆弱，所以可要儘快將DMSO去除，一定要輕。

儲存方法（主要有兩個）：

（1）傳統方法：冷存管置於4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程式降溫：利用已設定程式的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用於懸浮型細胞與hybridoma之儲存。