在進行DNA分子重組操作中，往往有許多因素會影響到DNA片段的連線，包括連線反應的溫度、ATP濃度、連線酶濃度、反應時間、不同DNA片段末端的相對濃度和離子濃度等。
1. 反應溫度
溫度是影響DNA連線效率的主要因素。連線酶的最佳反應溫度是37℃，但是在這個溫度下，粘性末端之間退火形成的氫鍵結合是不穩定的。因此，連線粘性末端的最適溫度一般認為4~16℃比較合適。
平末端連線反應受溫度的影響較小，連線反應的最適溫度為10~20℃，一般可在室溫下進行，但溫度過高（>30℃）也會導致T4 DNA連線酶的不穩定。
2. 連線酶濃度
37℃，20 min內可使l nmol/L 32P在有機焦磷酸與ATP之間產生交換的酶量為1個活性單位。在平末端DNA分子的連線反應中，最適的反應酶量大約是1~2個單位；同樣條件下，粘性末端DNA片段間的連線所用酶濃度為0.1個單位時，便可獲到較高的連線效率。
3. ATP濃度
ATP濃度對酶的影響很大，其反應終濃度變化範圍應在10 μmol/L～1 mmol/L，一般情況下ATP最適終濃度為0.5 mmol/L。ATP濃度上升至5.0 mmol/L時，將影響對平末端的連線；ATP為7.5 mmol/L時，對粘性末端及平末端的連線均會產生抑制作用。
4. DNA片段末端
在反應體系中，由於DNA末端之間的相互競爭，可形成自身環化、線形二聚體和環化二聚體3種不同構型的DNA分子。
在一定濃度下，小分子 DNA片段進行分子內連線，有利於形成環化分子。對於長度一定的DNA分子，其濃度降低有利於分子環化。DNA濃度增加有利於分子間的連線，形成線性二聚體或多聚體分子。要使載體DNA與外源插入片段連線形成重組體，不僅要考慮反應體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段末端濃度的比例。原則上，應該保證一個DNA分子的末端具有較高的機率與另一個DNA分子連線，減少同一個分子兩個末端之間的自身連線，以達到重組的目的。
在進行DNA分子重組操作中，往往有許多因素會影響到DNA片段的連線，包括連線反應的溫度、ATP濃度、連線酶濃度、反應時間、不同DNA片段末端的相對濃度和離子濃度等。
1. 反應溫度
溫度是影響DNA連線效率的主要因素。連線酶的最佳反應溫度是37℃，但是在這個溫度下，粘性末端之間退火形成的氫鍵結合是不穩定的。因此，連線粘性末端的最適溫度一般認為4~16℃比較合適。
平末端連線反應受溫度的影響較小，連線反應的最適溫度為10~20℃，一般可在室溫下進行，但溫度過高（>30℃）也會導致T4 DNA連線酶的不穩定。
2. 連線酶濃度
37℃，20 min內可使l nmol/L 32P在有機焦磷酸與ATP之間產生交換的酶量為1個活性單位。在平末端DNA分子的連線反應中，最適的反應酶量大約是1~2個單位；同樣條件下，粘性末端DNA片段間的連線所用酶濃度為0.1個單位時，便可獲到較高的連線效率。
3. ATP濃度
ATP濃度對酶的影響很大，其反應終濃度變化範圍應在10 μmol/L～1 mmol/L，一般情況下ATP最適終濃度為0.5 mmol/L。ATP濃度上升至5.0 mmol/L時，將影響對平末端的連線；ATP為7.5 mmol/L時，對粘性末端及平末端的連線均會產生抑制作用。
4. DNA片段末端
在反應體系中，由於DNA末端之間的相互競爭，可形成自身環化、線形二聚體和環化二聚體3種不同構型的DNA分子。
在一定濃度下，小分子 DNA片段進行分子內連線，有利於形成環化分子。對於長度一定的DNA分子，其濃度降低有利於分子環化。DNA濃度增加有利於分子間的連線，形成線性二聚體或多聚體分子。要使載體DNA與外源插入片段連線形成重組體，不僅要考慮反應體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段末端濃度的比例。原則上，應該保證一個DNA分子的末端具有較高的機率與另一個DNA分子連線，減少同一個分子兩個末端之間的自身連線，以達到重組的目的。