膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,金離子還原後聚合成的一定大小的金顆粒,它由一個基礎的晶核(11個金原子形成的二十面體)和包圍在外的雙離子層構成(內層為負離子層AuCl2-,外層是帶正電荷的H+)。
由於靜電作用,金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩定的膠體狀態,形成帶負電的疏水膠溶液,故稱膠體金。
膠體金在弱鹼環境下帶負電荷,可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合,由於這種結合是靜電結合,所以不影響蛋白質的生物特性。
除了與蛋白質結合以外,它還可以與許多其它生物大分子結合,如SPA、PHA、ConA等。
根據膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應,加上結合物的免疫和生物學特性,因而使膠體金廣泛地應用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
膠體金標記,實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。用於膠體金標記的蛋白必須要經過前處理,其目的在於
(1)去除高濃度的鹽分,高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結合,或導致膠體金粒子的凝聚,這一步往往採用低濃度緩衝液中進行。
(2)使蛋白分子儘量分散為單體,凍幹蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子,可同時與多個膠體金粒子結合,影響標記的靈敏度和定量分析。
(3)使蛋白具有適當的分子量。蛋白分子量過小(30kD),形成的蛋白複合體往往是不穩定,可短時間內失活。
而分子量過大時,被認為影響探針的靈敏度,特別是已知蛋白的結構與活性中心的情況下,去除對活性影響的結構部分是提高標記靈敏度,延長探針壽命(防止凝集)的有效辦法。
把分子量過小的蛋白與其它蛋白(如牛血清蛋白等)結合後,能製備出穩定性更佳的探針。
當蛋白前處理完成後,接著要確定膠體金與蛋白結合的最佳pH值。對於理化性質不確定的蛋白這一步尤為重要。
過量的蛋白與不同pH值得膠體金結合後,只有某一特定pH值能夠形成結合最穩定的探針。在高濃度電解質(如NaCl)作用下不會凝
聚。不同蛋白的適宜pH範圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些探針的實際情況並不完全如此,最穩定的探針並不完全代表活性最好,這要靠實驗驗證。
在確定最佳pH值後,最後要確定最小蛋白量,即能夠形成穩定探針的蛋白的最小量。如果在製備探針時加入太多的蛋白,不僅造成浪費,而且更為嚴重的是容易造成探針凝聚,並嚴重影響標記活性。
因為探針溶液中的遊離蛋白容易搶先與標記位點結合,起到“封閉”(Blocking)作用,而膠體金探針標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。
膠體金具有很高的動力學穩定性,在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢,可放置數年不發生凝聚。影響穩定的因素主要有
電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。金溶膠必須有少量電解質作穩定劑,但濃度不宜過高。
高濃度親水性非電解質能剝去膠粒外面的水化膜使其凝聚。
少量的高分子物質促使溶膠凝聚,但一定量的高分子物質反而可增加溶膠穩定性,如蛋白質、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩定效果。
當金溶膠吸附蛋白質後,溶膠的穩定性隨溶液pH而變化,而這種變化又取決於吸附蛋白質的等電點,如ConA,過氧化物酶等,當pH較低時保持穩定,提高pH則顯得不穩定,接近等電點或略高時又變得穩定了。
標記後的膠體金溶液可用0.2~0.5mg/mlPEG20000 作為穩定劑。在4~10℃貯存數月有效,不宜冰凍。貯存中可能會發生程度不同的凝聚,可離心除去。
膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,金離子還原後聚合成的一定大小的金顆粒,它由一個基礎的晶核(11個金原子形成的二十面體)和包圍在外的雙離子層構成(內層為負離子層AuCl2-,外層是帶正電荷的H+)。
由於靜電作用,金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩定的膠體狀態,形成帶負電的疏水膠溶液,故稱膠體金。
膠體金在弱鹼環境下帶負電荷,可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合,由於這種結合是靜電結合,所以不影響蛋白質的生物特性。
除了與蛋白質結合以外,它還可以與許多其它生物大分子結合,如SPA、PHA、ConA等。
根據膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應,加上結合物的免疫和生物學特性,因而使膠體金廣泛地應用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
膠體金標記,實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。用於膠體金標記的蛋白必須要經過前處理,其目的在於
(1)去除高濃度的鹽分,高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結合,或導致膠體金粒子的凝聚,這一步往往採用低濃度緩衝液中進行。
(2)使蛋白分子儘量分散為單體,凍幹蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子,可同時與多個膠體金粒子結合,影響標記的靈敏度和定量分析。
(3)使蛋白具有適當的分子量。蛋白分子量過小(30kD),形成的蛋白複合體往往是不穩定,可短時間內失活。
而分子量過大時,被認為影響探針的靈敏度,特別是已知蛋白的結構與活性中心的情況下,去除對活性影響的結構部分是提高標記靈敏度,延長探針壽命(防止凝集)的有效辦法。
把分子量過小的蛋白與其它蛋白(如牛血清蛋白等)結合後,能製備出穩定性更佳的探針。
當蛋白前處理完成後,接著要確定膠體金與蛋白結合的最佳pH值。對於理化性質不確定的蛋白這一步尤為重要。
過量的蛋白與不同pH值得膠體金結合後,只有某一特定pH值能夠形成結合最穩定的探針。在高濃度電解質(如NaCl)作用下不會凝
聚。不同蛋白的適宜pH範圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些探針的實際情況並不完全如此,最穩定的探針並不完全代表活性最好,這要靠實驗驗證。
在確定最佳pH值後,最後要確定最小蛋白量,即能夠形成穩定探針的蛋白的最小量。如果在製備探針時加入太多的蛋白,不僅造成浪費,而且更為嚴重的是容易造成探針凝聚,並嚴重影響標記活性。
因為探針溶液中的遊離蛋白容易搶先與標記位點結合,起到“封閉”(Blocking)作用,而膠體金探針標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。
膠體金具有很高的動力學穩定性,在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢,可放置數年不發生凝聚。影響穩定的因素主要有
電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。金溶膠必須有少量電解質作穩定劑,但濃度不宜過高。
高濃度親水性非電解質能剝去膠粒外面的水化膜使其凝聚。
少量的高分子物質促使溶膠凝聚,但一定量的高分子物質反而可增加溶膠穩定性,如蛋白質、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩定效果。
當金溶膠吸附蛋白質後,溶膠的穩定性隨溶液pH而變化,而這種變化又取決於吸附蛋白質的等電點,如ConA,過氧化物酶等,當pH較低時保持穩定,提高pH則顯得不穩定,接近等電點或略高時又變得穩定了。
標記後的膠體金溶液可用0.2~0.5mg/mlPEG20000 作為穩定劑。在4~10℃貯存數月有效,不宜冰凍。貯存中可能會發生程度不同的凝聚,可離心除去。