引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

PCR的過程：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

有些是用引物的Tm值－5℃作為退火溫度，其實也沒必要完全按照這個公式來計算。退火溫度跟酶和buffer有關，不同廠家可能不一樣。

一般在實驗過程中將退火溫度設置在55－60℃之間就可以。

沒有目的片段可以從以下幾個方面考慮:

1. 含有PCR反應抑制物

對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 後再擴增，並通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進行擴增，驗證抑制物的存在；

2. 模板濃度太低，擴增循環數不夠

盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的最低溫度增加10個擴增循環；

3，非特異擴增

增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，採用降落PCR和熱啟動PCR

4. 擴增反應混合液中各成分濃度不對

改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩衝液的pH

5. 原始模板濃度太低

使用巢式引物對第一次擴增產物進行稀釋（l :100 和1:1000)後擴增；

6. 擴增需要增強劑

加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亞楓CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增強劑

7. 引物設計存在問題

重新設計引物