經典cDNA文庫構建的基本原理：用Oligo（dT）作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得cDNA文庫。

其基本步驟包括：

（1）mRNA的提純獲取高質量的mRNA是構建高質量的cDNA文庫的關鍵步驟之一。

（2）cDNA第一條鏈的合成。

（3）cDNA第二條鏈的合成。

（4）雙鏈cDNA的脩飾。

（5）雙鏈cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文庫的擴增。

（7）cDNA文庫鑒定評價。

反轉錄是以RNA為模板，通過反轉錄酶，合成DNA的過程。是DNA生物合成的一種特殊方式。

反轉錄是進行基因工程過程中，以RNA為模板提取出DNA遺傳信息的過程。

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反轉錄也稱為逆轉錄

反轉錄過程由反轉錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉錄酶存在於一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉化有關。人類免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有反轉錄酶，推測可能與細胞分化和胚胎發育有關。

大多數反轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。

②RNase H活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA5′端水解掉RNA分子。

③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。