基因工程操作中涉及一系列相互關聯的酶促反應。已經知道有許多重要的核酸酶，如限制性內切核酸酶、外切核酸酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、反轉錄酶、DNA及RNA的脩飾酶等，在基因工程的操作中有著廣泛的用途。

1.限制性內切核酸酶

限制性內切核酸酶(restrictionendonuclease)是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，並在合適的條件下使每一條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產生具有3/—OH基團和5/—P基團的DNA片段的內切脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。至今發現的限制性內切核酸酶有I型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，它們各具特性。基因工程中所說的限制性內切核酸酶都是指Ⅱ型酶。

限制性內切核酸酶把目的基因從只有四種鹼基A、T、G、C組成的DNA長鏈(人類DNA長度為3X109個鹼基對)中準確地剪切下來。每一種限制性內切核酸酶的識別位點是固定的，如EcoRI的識別位點是GAATTC及其互補序列CTTAAG。

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基因工程中常用聚合酶（鹼性磷酸酶）。

基因工程，又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然後導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品的遺傳技術。基因工程技術為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。

基因工程中廣泛應用的鹼性磷酸酶：

一種是從大腸桿菌提取的BAP，另一種是從牛小腸提取的CIP。

兩種鹼性磷酸酶均能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5′磷酸基，產生5′羥基末端。兩種酶反應均需Zn2+。區別在於BAP耐熱，而CIP在70℃加熱10分鐘或經酚抽則滅活；CIP的特異活性較BAP高出10～20倍。因此，CIP應用更廣泛。