pcr選擇50℃作為退火溫度的參考溫度是因為一般引物tm值大概位於48～55℃，但是這僅僅是參考值，退火溫度一般為引物最低tm值減2，或平均tm值減4，而且要獲得最好結果一般需要進行優化。

pcr沒有產物，有時候可以進行條件優化獲得成功。

pcr沒有產物主要有五方面原因：引物專一性不好，模板濃度偏低，退火溫度偏高，聚合酶活性低，延伸時間不夠等等。現在一般都採用試劑盒和推薦的優化持續，質量基本有保證，因此，常見的主要原因絕大多數與引物和模板有關。

在模板，試劑盒沒有問題前提下，一般都是進行引物和退火溫度優化。一般降低退火溫度為tm-3～5℃，但最好不要低於50℃。最好在此範圍內做一個梯度pcr，基本就能找到最佳pcr條件。如果還不能獲得產物，建議重新設計引物。

PCR中退火的那步是引物與模板結合，一般來說，退火溫度比Tm值要低上5度左右。另外，也可以根據你設計引物的軟件比如primer5.0或Olige 6 推薦的溫度。但這些都不是絕對的。

退火溫度選擇一個範圍，如50-60度，PCR儀器在一排（12個孔）或一列（8個孔）中每個孔的溫度都不同，你在相應的孔中放入待反應的PCR混合液（保證每孔中反應液一致），記錄相應的溫度，PCR產物經瓊脂糖凝膠或PAGE凝膠電泳檢測目的產物濃度，有無非目的產物等。