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1 # 用戶3649632974868
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2 # 落日餘暉琪
延伸是根據酶的種類和片段長度決定的, 退火溫度根據引物來決定 一般先用55° 不行的話再往下降
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3 # 用戶9481721646281
PCR實驗是一種體外擴增DNA的技術,其過程中需要根據不同的引物、模板DNA和酶的特性來調整不同的時間和溫度。以下是一些常見的PCR實驗過程中需要調整的因素:
引物的長度和Tm值:引物是PCR擴增的關鍵因素之一,其長度和Tm值會影響PCR反應的特異性和效率。通常情況下,引物的長度在18-24個鹼基對之間,Tm值在55-65℃之間。如果引物長度較長或Tm值較高,需要增加退火溫度和時間,以確保引物與模板DNA的特異性結合。
模板DNA的濃度和質量:模板DNA的濃度和質量也會影響PCR反應的效率和特異性。如果模板DNA濃度較低,需要增加PCR循環次數或延長擴增時間,以提高PCR產物的數量。如果模板DNA質量較差,可能需要增加退火溫度和時間,以提高引物與模板DNA的特異性結合。
酶的活性和穩定性:PCR反應中使用的酶通常是熱穩定的DNA聚合酶,其活性和穩定性會受到溫度、pH值、離子濃度等因素的影響。如果酶的活性較低,需要增加酶的用量或延長擴增時間,以提高PCR產物的數量。如果酶的穩定性較差,可能需要降低退火溫度和時間,以減少酶的失活。
總之,PCR實驗過程中需要根據不同的引物、模板DNA和酶的特性來調整不同的時間和溫度,以確保PCR反應的特異性和效率。
和taq酶和所擴增的片段長短有關。
pcr的延伸就是當引物結合到模板上時,會在聚合酶的作用下進行延伸擴增,目前市面上不同的商品化聚合酶延伸速度不一樣,一般的聚合酶延伸速度在30-60s/kb,有些快速的taq酶擴增速度可以達到幾秒/kb,所以不同taq酶延伸速度不一樣,所設置的延伸時間也就不一樣,同理擴增不同長度的片段延伸的時間也就不同,通常是擴增片段越長延伸時間越長。