tRNA主要功能是在細胞翻譯過程中起識別密碼子和轉運氨基酸的作用。作為“搬運工具”的tRNA有很多種，體內20種氨基酸都有其自已特有的tRNA，所以，tRNA的種類不少於20種。tRNA在ATP供應能量和酶的作用下，可分別與特定的氨基酸結合。每個tRNA都有一個由三個核苷酸編成的“反密碼”。

trna的作用主要是攜帶氨基酸進入核糖體，在mRNA指導下合成蛋白質。即以mRNA為模板，將其中具有密碼意義的核苷酸順序翻譯成蛋白質中的氨基酸順序（見蛋白質的生物合成、核糖體）。tRNA與mRNA是通過反密碼子與密碼子相互作用而發生關係的。

在肽鏈生成過程中，第一個進入核糖體與mRNA起始密碼子結合的tRNA叫起始tRNA，其餘tRNA參與肽鏈延伸，稱為延伸tRNA，按照mRNA上密碼的排列，攜帶特定氨基酸的tRNA依次進入核糖體。形成肽鏈後，tRNA即從核糖體釋放出來。