2017年諾貝爾化學獎得主、美國國家科學院院士、美國哥倫比亞大學Joachim Frank教授曾多次到訪清華，此次巔峰對話以線上會議方式向同學們講解冷凍電鏡的前世今生，帶領大家領略原子維度的重構藝術，並針對學生挑戰團隊的提問進行解答。清華大學生命學院院長、化學-生物大類首席教授王宏偉老師作為對話嘉賓出席活動。
文稿 | 阿希姆·弗蘭克、劉鍾靈 、周珩
編輯 | 於億航、周聖鈞、胡筱箐、姜晶博、高松齡、邱雨浩
稽核 | 趙鑫、張可人
人物簡介
阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）教授，德裔生物物理學家，美國國家科學院院士，現任美國哥倫比亞大學教授，研究領域包括生物化學、分子生物物理學等。1975年到2008年間，弗蘭克教授完善了電子顯微鏡影象處理的單顆粒演算法，發明了SPIDER軟體，該軟體至今為全世界上百家實驗室廣泛使用。弗蘭克教授應用冷凍電鏡和單顆粒技術，在解析原核和真核細胞核糖體結構和功能領域做出了非凡的貢獻。弗蘭克教授在2017年10月獲得諾貝爾化學獎，以表彰他在“冷凍電鏡，用於生物分子結構的高解析度解析”做出的巨大貢獻。
01 冷凍電鏡誕生髮展的歷程
提到冷凍電鏡的誕生歷程，故事還得從一個動物細胞講起。基於還原論（Reductionism，在生物學領域可理解為將生命過程還原為分子運動規律、物理-化學過程），要理解生命，則要更進一步到達分子的層面。1998年Bruce Alberts提出了“分子機器”（molecular machine）概念：細胞內分子並非散亂碰撞，而是透過組裝井然有序地行使功能。ATP合成酶、蛋白酶體、分子伴侶、剪接體，以及Frank教授實驗室的主要研究物件——核糖體等，都是分子機器。我們既希望瞭解分子機器的組分結構，也希望知道組分間動態互作的方式。
在冷凍電鏡技術誕生前的1968年，Frank教授當時還是一名研究生，Walter Hoppe和Max Perutz組織了一次X-ray crystallography 和EM of proteins領域的交流會，席間有Richard Henderson、Hugh Huxley、Nigel Unwin等人出席。由此可見，為解析更多生物大分子的組分與結構，此時X射線晶體學和蛋白電子顯微技術領域的交流已經十分頻繁了。
X射線晶體學是解析生物大分子結構的老牌手段，但其弊端在於無法觀測分子的多種構象或結合狀態、樣品量需求大，最大的問題是許多分子並不形成規律晶體。電子顯微鏡技術也可用於解析分子結構，但要求樣品極薄，且高能電子會損傷分子結構，最終得到的二維影象是分子的投影。
那麼，是否可以利用二維投影獲得三維重構呢？在1968年至1975年間，出現了三篇開創性的工作：1968年，劍橋MRC實驗室的Aaron Klug和De Rosier獲得了T4噬菌體尾部的三維結構；1971年，Tony Crowther獲得了番茄叢矮病毒的三維結構；1975年，Richard Henderson和Nigel Unwin獲得了細菌紫紅質的三維結構。但前兩項工作均利用了分子的特殊對稱性，後一項工作只能適用於少數能夠生長為二維晶體的分子，其方法均不具有普適性。
Frank教授當時的導師Walter Hoppe認為，三維重構並不一定要求分子具有特殊對稱性或生長為晶體，對於沒有對稱性的分子，也可以透過拍攝多角度的電子顯微照片，獲取多個角度的投影進行三維重構，即電子斷層掃描技術。但Frank透過計算發現，這種方法累積的電子劑量將對分子造成嚴重的輻照損傷，使得重構毫無意義。經過進一步思考，Frank進而提出了單顆粒三維重構的概念：經過提純後的分子在溶液中有很多複製，它們可能包含各種自然構象，其空間取向也是隨機的，一張影象即可囊括該分子很多空間取向；當我們獲取足夠多的影象之後，就可以獲得該分子所有方向的投影以完成三維重構。在提出這一方法之後，Frank又與Saxon合作，在理論上證明了這一方法的可行性，但阻礙課題進展的還有很多技術性難題。Frank領導開發了第一個單顆粒三維重構的軟體包SPIDER，並不斷納入新的計算工具，以攻克這些技術難題。
有了好的計算工具，還需要有好的測試樣品。在1980年一次關於單顆粒技術的講座中，一位名為Miloslav Boublik的參會者向Frank教授展示了其拍攝到的Hela細胞核糖體清晰的電子顯微影象。核糖體具有相對穩定的構象和適當的大小， Frank教授意識到這正是最佳的測試樣品。在當時，人們對核糖體的結構知之甚少，也沒有可靠的三維重構方法，僅有Jim Lake對核糖體進行“肉眼重構”的粗略的三維模型。Frank教授繼而以核糖體為研究物件，在1979-1986年間開發出隨機圓錐傾斜（Random Conical Tilt）三維重構方法，最終在1986年獲得了大腸桿菌核糖體50S亞基的三維結構，使三維重構技術走向實用。
2012年以前，冷凍電鏡的解析度曾一度受制於傳統的CCD探測器和攝影膠片；2012年，直接電子探測相機的成功開發，使得相機的量子探測效率（Detection Quantum Efficiency）大幅提高，開啟了“解析度革命”，帶領冷凍電鏡技術進入新紀元。Frank教授分享了多個在此之後解析度達到3Å左右的精彩解析案例。教授指出冷凍電鏡技術不僅可以幫助我們預測mRNA和tRNA結合情況、定位分子結合位點等，在本次新冠疫情中，冷凍電鏡技術也極大程度幫助科學家確定了新型冠狀病毒SARS-CoV2與人體細胞受體結合以及與抗體結合的結構，助力快速鑑定病毒的突變與進化。近年來，每年利用冷凍電鏡技術解析的生物大分子結構數量已經超越了核磁共振，並仍在迅猛攀升。
目前冷凍電鏡技術依舊在革新之中，Frank教授以團隊最近的核糖體翻譯終止過程研究為例，講述時間分辨的冷凍電鏡技術（Time-resolved cryo-EM）結合精確控制的噴霧-混合系統可捕捉非常迅速的蛋白質構象變化；影象處理方法流形嵌入（Manifold Embedding）可以分辨出更為細緻的動力學變化，進而實現對生物分子連續的結構變化過程的研究。
冷凍電鏡單顆粒技術對結構生物學發展的意義非凡，並將在未來學科的發展中繼續發揮巨大潛能。
生命學院博士後周珩：“Frank教授做的核糖體可以解析出很多種構象的結構，但是我所做的機械力敏感的陽離子通道Piezo2卻具有高度的柔性，透過三維分類可以分出多種構象，但只有其中最穩定的構象可以解析到近原子解析度。那麼如何解析不穩定的中間構象的高解析度結構呢？如果中間構象是由兩種成分的反應產生的，那麼時間分辨的冷凍電鏡技術（Time-resolved cryo-EM）可以捕捉到這種中間構象，但是Piezo通道的中間構象是由施加機械力造成的，還有一些離子通道的中間構象是由膜電勢變化或者跨膜的電化學梯度引起的，這些中間構象就不能透過Time-resolved cryo-EM獲得其高解析度結構。那麼未來單顆粒冷凍電鏡能否解決這個問題呢？”生命學院劉俊傑老師：“我建議需要針對蛋白的性質做不同的處理，如果這種中間構象可以被特定的化學物質所穩定，那麼就需要新增這種化學物質來使其穩定在這種構象，以解析結構；對第二個問題，我認為Time-resolved cryo-EM只是一個思路，確實它不能解析機械力、電勢變化和跨膜電化學梯度引起的中間構象，但是可以用類似的思路設計專門針對這些離子通道的制樣裝置，用以解析其結構。”周珩：“尤其針對跨膜電化學梯度引起的中間構象，可以透過將蛋白重組至脂質體上，人為地控制脂質體內外的電化學梯度，從而解析這類特殊的蛋白的中間構象。”Frank教授：“第一個問題可採用Manifold embedding的方法，只要這種構象不是佔比特別少，就可能透過這種方法解決，但是一般需要收集大量的資料。”周珩：“Manifold embedding可以研究一種分子機器的多種構象間是以怎樣的能量路線發生變化的，的確可以用來研究中間構象，但是並不能透過這種方法直接獲取不穩定中間構象的高解析度結構。”Frank教授：“的確當前的方法無法解析這類離子通道的開放構象，可能需要具有工程學智慧的研究者開發專門的制樣裝置以解析其結構。也許第一個開發者就是你。”
生命學院博士生陳康淨：“關於單顆粒冷凍電鏡技術中結構異質性，Frank教授發表過一種Manifold Embedding的方法，結合我自己的工作，在RSC-NCP複合物結構解析過程中，我們的密度中有一部分嘗試了很多計算上和生化上的方法都沒有解決。請問Frank教授，Manifold EM方法的主要適用範圍如何，以及如何分析結構中的異質性從而選擇合適的方法呢？”
Frank教授：“Manifold Embedding方法目前只在核糖體和RyR的結構解析中應用的比較好，對於其他大分子仍在研究。”
王宏偉老師：“其實很多中間構象並不重要，沒有太大生物學意義，我們只需要解析一些有重大生物學意義的結構即可。生物大分子的柔性目前也是結構生物學的難題，針對剪接體Manifold EM方法就不太適用。”
生命學院博士生徐家璐：“Frank教授談到冷凍電鏡解析度革命正在發生；討論中王宏偉老師預計冷凍斷層成像子斷層平均法（sub-tomogram average）的近原子解析度會比想象中地更快到來。”
王宏偉老師總結：“Frank的博士導師是Walter Hoppe，Frank質疑自己導師的觀點，獨闢蹊徑開發了單顆粒重構技術。但是Walter Hoppe也並沒有放棄自己的想法，他後來還有另一個學生叫Wolfgang Baumeister，繼續他的道路，經過幾十年的研究，終於將這一技術也發展起來，成為電子顯微學另一主要分支cryo-ET領域的主要奠基人。我鼓勵大家在科研的道路上，大膽質疑，堅持求索。”
巔峰對話TopTalk簡介
清華大學“巔峰對話”（Toptalk）是由清華大學研究生會於2013年發起並主辦的多學科學術交流活動。透過邀請以諾貝爾獎、圖靈獎、菲爾茲獎為主的各學科國際學術大師，為清華學生搭建與大師同臺對話的平臺，鼓勵清華學生質疑學術權威、挑戰現有學術正規化，培養同學們的批判性思維和創新能力，力求“對話激發創新”。“巔峰對話”系列活動已經走過7個年頭，累計邀請到超過20位諾貝爾獎得主，7點陣圖靈獎得主，1位菲爾茲獎得主來到紫荊之巔。