郭衍教授、醫學博士。1994年畢業於第四軍醫大學。現任中華醫學會會員；上海醫學會神經外科專業委員會腫瘤組成員。國內外核心期刊發表學術論文10餘篇，參與獲得局級以上課題數項。主攻方向為顯微神經外科治療、單鼻孔經蝶垂體腺瘤手術。 從事神經外科臨床工作20多年，擅長腦膠質瘤的基礎研究與治療；重型顱腦創傷救治；自發性腦出血的微創治療；椎管腫瘤的手術治療。

　　細胞凋亡是形態學上對細胞程式性死亡的描述。在此過程中細胞膜小泡化、皺縮, 染色體聚縮、斷裂, 整個細胞成為球形小泡, 從而迅速被周圍細胞吞噬。許多因素可以啟用程式性死亡, 如細胞外因子FAS 抗原、TNF 基質粘附因子以及細胞內事件DNA損傷和p53活化等。干擾素具有抗病毒、調節細胞生長、抑制腫瘤血管形成以及調節免疫等多種功能, 已被廣泛用於治療多種腫瘤, 其抗腫瘤機制中的某些細節尚不完全清楚, 為了進一步探討IFN-β與膠質瘤細胞凋亡的關係, 本實驗將人IFN -β 真核表達載體pSV 2 IFN-β 轉染至膠質瘤細胞SHG 44內, 觀察它對細胞凋亡的影響, 並探討其意義。

1　材料和方法

1. 1　主要材料　IFN-β 真核表達載體pSV2 IFN-β由日本名古屋大學醫學部Yoshida J教授惠贈。膠質瘤細胞株SHG44 由本校全軍神經外科研究所提供。脂質體、兔抗人IFN-β 單抗由英國Pepro tech公司提供;DMEM 由G ibco公司提供。

1. 2　基因轉染　採用脂質體載體將pSV 2 IFN-β(15 nmol脂質體含0. 3 μg DNA)轉染膠質瘤細胞株SHG44。轉染2 d後棄去原培養液, 加入含血清DMEM 培養液, 在標準環境下培養, 6 d後收集細胞並製備細胞爬片, 固定於40 g /L多聚甲醛)(PFA ) /PBS(pH 7. 4)中。

1. 3　免疫熒光法檢測IFN-β 表達　細胞爬片PBS振洗5m in ×1 次, 經10 m l /L過氧化氫/PBS、3 m l /LTriton X-100 /PBS 處理後滴加兔抗人IFN-β 單抗(用PBS 按1 ∶100 稀釋), 置溼盒內37℃孵育30m in, PBS振洗5 m in ×3次, 滴加羊抗兔FITC-IgG(用PBS按1∶10稀釋), 置溼盒內37℃孵育30m in,PBS 振洗5 min ×2 次, 蒸餾水洗5m in ×1 次,500 m l /L緩衝甘油封片。對照組採用空載體轉染SHG44膠質瘤細胞。熒光顯微鏡下觀察並攝片, 陽性標準為胞膜黃綠色熒光。

1. 4　免疫組化　細胞爬片經10 m l /L過氧化氫/PBS、3m l /L TritonX-100 /PBS 處理後滴加正常羊血清37℃溫育30 m in, 棄去血清後滴加兔抗人IFN-β單抗IgG, 4℃過夜, 滴加生物素化的羊抗兔IgG, 37℃溫育30 m in, 滴加ABC 複合物37℃溫育30 m in, 上述各步之間均以PBS充分振洗。最後浸入新鮮配製的DAB 顯色液, 室溫10 min, 蒸餾水洗終止反應, 蘇木精襯染, 逐級酒精脫水後二甲苯透明, 中性樹膠封片。

1. 5　A nnexin V 凋亡檢測　將pSV2 IFN-β 轉染膠質瘤細胞株SHG44 6 d後, 調整細胞濃度為5 ×105～ 1 ×106 個/m l, 取1 m l細胞, 1 000 r /m in 4℃離心10 m in, 棄上清, 加入1m l冷的PBS, 輕輕震盪使細胞懸浮, 1 000 r /m in 4℃離心10m in, 棄上清, 重複2次。將細胞重懸於200 μl B inding Buffe r, 加入10 μlAnnex in V-F ITC 和5 μl PI, 輕輕混勻, 避光室溫反應15 m in, 加入300 μl B inding Buffe r, 1 h內上機檢測,對照組採用空載體轉染SHG44膠質瘤細胞。

1. 6　透射電鏡檢測細胞凋亡　分別將轉染組及親本細胞SHG44用0. 25%胰蛋白酶消化計數後(約1. 5 ×106 個細胞), 用4℃預冷的PBS 1. 5m l重懸,加入1. 5 m l離心管中, 2 000 r /m in ×10m in, 棄上清, 再加入4℃預冷的PBS 1. 5 m l, 重懸後離心, 重複3次。加入4℃預冷的2%戊二醛4m l, 4℃固定1 h後送電鏡中心檢測。

2　結　果

2. 1　熒光顯微鏡下觀察, 陽性為胞漿黃綠色熒光(見圖1), 而對照組細胞為陰性(見圖2), 證明人IFN-β 成功匯入細胞, 並有較高表達。

2. 2　免疫組化在轉染細胞的胞漿中有棕色陽性訊號(見圖3), 對照組細胞為陰性, 說明人IFN-β 基因在SHG44細胞中得到表達。

2. 3　Annexin V 凋亡檢測結果　A 為轉染組, B 為對照組, 每組四個象限依次為活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞數。凋亡細胞呈An-

2. 4　透射電鏡檢測細胞凋亡, 凋亡的SHG 44膠質瘤細胞體積縮小, 胞膜完整, 染色質凝集, 附著於核內膜處, 呈半月狀, 核仁消失, 細胞核與細胞質電子密度加深(見圖5)。

3　討　論

目前認為其主要透過兩種途徑對腫瘤發揮效應, 一是動員機體自身的免疫系統去攻擊腫瘤, Nakahara等研究發現β 干擾素能提高系統性的細胞免疫, 抑制膠質瘤細胞增殖[ 1] ;二是對腫瘤細胞的直接作用, 目前後者已越來越引起人們的關注。干擾素可直接誘導腫瘤細胞凋亡, 研究發現干擾素可透過與細胞分化和生長相關的多種途徑來誘導黑色素瘤細

胞凋亡[ 2] ;干擾素可透過誘導C-myc表達的改變來調節細胞凋亡的敏感性, 在誘導凋亡過程中通常不改變Bc l-2、Bax 的表達[ 3] ;誘導腫瘤細胞凋亡的過程有賴於細胞中多種訊號傳導通路的開放、功能基因的轉錄和相互協同作用[ 4] 。細胞凋亡是正常組織細胞更新的過程, 是同增殖、分化機制一起共同維持機體內環境穩定的重要因素, 它為機體正常細胞的更新和異常細胞的清除提供了手段。細胞內部的基因直接控制著凋亡的發生和發展, 細胞外部因素透過訊號傳遞而影響這些基因的表達, 從而間接地調節凋亡。本實驗利用脂質體轉的方法轉染人β 干擾素基因至SHG44 膠質瘤細胞, 免疫組化和免疫熒光證明人IFN-β 基因在SHG44細胞中得到表達。本實驗發現轉染了人IFN-β 基因的膠質瘤細胞的生長明顯受到抑制, 對膠質瘤細胞具有很強的細胞毒性作用。本實驗採用Annex in V 凋亡檢測親本細胞活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞數, Annex in V 是一種Ca2 +依賴性磷脂結合蛋白, 能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的磷脂醯絲氨酸(Phosphatidy lse rine, PS)高親和力特異性結合, 並以標記了FITC 的A nnex inV 作為熒光探針, 利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。Propidium iodide(PI)是一種核酸染料, 它不能透過完整的細胞膜, 但在凋亡中晚期的細胞和亡死細胞中PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。將Annexin V與PI匹配使用, 可以將凋亡早期細胞和晚期細胞以及亡死細胞區分開來。本試驗顯示轉染了人β 干擾素基因的SHG44 膠質瘤細胞的早期凋亡細胞數明顯高於未轉染的親本細胞, 同時進行透射電鏡檢測, 觀察到典型的凋亡細胞超微結構特徵。雖然已有文獻報道外源性的人IFN-β 對膠質瘤有抗增殖作用[ 5] , 但轉染人IFN-β 基因的膠質瘤細胞SHG44在區域性不斷分泌高濃度的人IFN-β , 抑瘤效果更加明顯。β 干擾素對膠質瘤細胞的直接作用目前已越來越引起人們的關注, 在臨床上血管內注入β 干擾素,對惡性膠質瘤有療效[ 6] 。同時, 利用干擾素的誘導凋亡作用協同其它治療,例如與放療、化療同時進行, 以達到提高療效的目的。β 干擾素和ACNU、MCNU 等化療藥或放療聯合應用能提高化療藥對膠質瘤的毒性作用和放療效果[ 7, 8] 。β 干擾素無論是導致細胞週期阻滯或直接的細胞毒作用都對誘導膠質瘤細胞凋亡起作用, 關於β 干擾素誘導膠質瘤細胞凋亡作用的分子機制的研究還有待於進一步深化。

參考文獻

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