導讀越來越多的證據表明，腸道微生物群可以調節代謝穩態，從而可能影響妊娠期糖尿病（GDM）的發生發展。然而，在妊娠期糖尿病中，腸道微生物群及其相關代謝物是否改變以及如何改變還不確定。本研究中比較了59例妊娠期糖尿病患者和48例妊娠健康對照（HCs）的腸道微生物組成以及糞便和尿液代謝物。發現妊娠期糖尿病患者的微生物和代謝特徵與HC患者明顯不同。與HC相比，妊娠期糖尿病患者具有豐富的乳螺科細菌和腸桿菌科和反芻球菌科的OTU缺失的特點。某些腸道微生物改變與血糖值和胎兒超聲指標顯著相關。此外，鑑定了4種糞便代謝物和15種尿代謝物來區分妊娠期糖尿病和HC。這些差異代謝物主要參與碳水化合物和氨基酸的代謝。本研究鑑定了一種新的組合標記板，可以高精度地區分GDM和HC受試者。研究結果表明，微生物組成和代謝功能的改變可能與妊娠期糖尿病的發病機制和病理生理有關。
論文ID原名：Altered gut bacterial and metabolic signatures and their interaction in gestational diabetes mellitus譯名：妊娠期糖尿病腸道細菌和代謝特徵改變及其相互作用期刊：Gut Microbes
影響因子：7.74
發表時間：2020.11
通訊作者單位：重慶醫科大學第一附屬醫院
Web results那不勒斯腓特烈二世大學
實驗設計
主要內容
1 招募物件的臨床特徵
在這項研究中共納入59例妊娠期糖尿病患者和48例HC患者。兩組的平均年齡或體重指數無顯著差異。妊娠12周時，GDM組的空腹血糖（FBG）水平高於HC組。此外，妊娠24-28周時，妊娠期糖尿病組的空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗後1小時和2小時的血糖水平顯著高於對照組。其餘變數如新生兒體重、分娩孕周和取樣等沒有組間差異。妊娠24、30、37周時兩組胎兒超聲檢查的主要指標如雙頂徑、頭圍、腹圍無明顯差異。有趣的是，與HCs組相比，妊娠37周時GDM母親的胎兒股骨長度略短。
2 妊娠期糖尿病母體微生物多樣性和組成改變
本研究採用16S rRNA基因測序方法，對妊娠期糖尿病（GDM）和妊娠健康對照（HCs）患者的微生物組成進行了比較。在107個糞便樣本中識別出4880685個高質量的讀數，平均長度為412.39。這些讀數可以歸類為1309個細菌OTU。GDM組和HC組共享1057個OTU，而GDM和HC組分別獨有125個和127個OTU（圖1a）。然後研究人員比較了兩組間的α多樣性指數。發現與HC相比，GDM患者的系統發育多樣性（PD）指數較低（圖1b）。相比之下，Shannon、Chao和Ace指數在兩組之間沒有差異（圖1c-e）。為了探討妊娠期糖尿病患者和HC患者的微生物組成是否不同，進行了β多樣性分析。為了直觀地顯示兩組之間的分離，進行了主成分分析（PCA）。發現GDM組和HC組的總體微生物組成顯著不同（圖2a）。
圖1 與HC相比，GDM的系統發育多樣性（PD）指數更低。（a）維恩圖顯示，兩組共檢出1309個OTU中的1057個，其中125個和127個OTU分別是妊娠期糖尿病和HC所特有的。（b）α系統發育多樣性分析表明，妊娠期糖尿病組的系統發育多樣性（PD）指數低於對照組。（c-e）其餘三項指標（Shannon、Chao、Ace）兩組間差異無統計學意義。
3 區分妊娠期糖尿病和HC的微生物特徵
用於區分GDM和HC的微生物特徵，LEFSE被用來識別區分GDM和HC的關鍵腸道微生物。總共確定了18個不同的OTU（圖2b）。與HC相比，GDM患者存在9個豐富的OTUS和9個缺失的OTUS和反芻球菌科，其中9個OTUS主要屬於乳頭菌科，而缺失的OTUS主要來自腸桿菌科。這18種不同的OTU主要屬於細菌門（13/18，72.2%）和變形桿菌（3/18，16.7%）。
4 妊娠期糖尿病孕婦糞便和尿液代謝特徵改變
由於腸道微生物區系調節宿主的代謝途徑，使用基於GC-MS的代謝組學方法來比較GDM受試者和HC患者的代謝特徵。妊娠期糖尿病患者的大便和尿液代謝特徵與HC組明顯不同（圖2c-d）。所有這些代謝物都主要參與氨基酸代謝（圖3a）。在尿樣中，GDM組和HC組之間有15種代謝物不同。與HCS相比，妊娠期糖尿病患者的特徵是3種上調的代謝物和12種下調的代謝物（圖3b）。功能聚類分析表明，這些尿代謝物與氨基酸和碳水化合物代謝相關。大便和尿液代謝分析表明，妊娠期糖尿病以宿主氨基酸和碳水化合物代謝紊亂為特徵。
圖2 與HC相比，GDM的腸道微生物和代謝特徵。（a）在OTU水平，主成分分析（PCA）顯示妊娠期糖尿病患者和HCS患者之間微生物組成的區別趨勢。（b）利用線性判別分析，確定了18個差異OTU對兩組之間的差異。（c-d）PLS-DA分析結果顯示GDM組與HCS組的大便、尿液代謝特徵有顯著差異。
圖3 妊娠期糖尿病患者糞便和尿液樣本中代謝產物的改變。（a）引起兩組間差異的4種糞便代謝物的相對丰度。與HCS相比，妊娠期糖尿病患者具有2個上調代謝物（紅色）和2個下調代謝物（黑色）的特徵。這些代謝物主要參與氨基酸代謝。（b）與HCS相比，妊娠期糖尿病患者有3個尿液代謝物上調（紅色）和12個尿液代謝物下調（黑色）。這些改變的尿代謝物主要屬於碳水化合物和氨基酸代謝。
5 妊娠期糖尿病母體血糖值和胎兒體格特徵與母體腸道細菌改變的關係
為進一步探討妊娠期糖尿病主要臨床指標與腸道菌群改變的潛在相關性，進行了相關分析。總體而言，包括妊娠12周的空腹血糖（FBG）值，以及妊娠24-28周的OGTT後1小時和2小時的空腹血糖（FBG）值在內的4個血糖值與一組細菌性OTUS均顯示出顯著的相關性（圖4）。例如，2個細菌OTU（腸桿菌科_OTU 123和反芻球菌科_OTU 93）呈負相關，1個細菌OTU（反芻球菌科_OTU229）與妊娠12周時的空腹血糖水平呈正相關。這一發現表明，這種微生物對妊娠期糖尿病具有潛在的預測價值。此外，妊娠24-28周時，2個OTU（229,992）和2個OTUS（253,511）與空腹OGTT血糖值呈負相關；3個OTU（247,672和992）與OGTT後1h血糖呈正相關，1個OTU（253）與OGTT後2h血糖呈負相關（圖4）。結果表明，乳酸菌_OTU 645與妊娠30周胎兒B超的腹圍、股骨長、雙頂徑、頭圍等四項指標呈顯著正相關，與胎兒腹圍、股長、雙頂徑、頭圍呈顯著正相關，與胎齡呈顯著正相關。重要的是，這些發現表明腸道菌群失調與孕婦血糖值和胎兒超聲測量的胎兒身體特徵高度相關。
圖4 血糖值、胎兒超聲指數和腸道細菌改變之間的關係。20項臨床指標的Spearman等級相關係數和18個腸道細菌OTU的熱圖隨年齡和BMI調整。妊娠12周（空腹血糖水平）和24-28周（OGTT）的不同血糖值與一組細菌性OTU呈顯著正相關，其中兩種OTU屬於乳螺科。此外，一些細菌性OTU與妊娠30周胎兒的腹圍、股骨長度等超聲指標也呈正相關。棕色方塊和藍色方塊分別表示正關聯和負關聯。
6 母體腸道細菌、糞尿代謝物和血糖水平改變的共生網路分析
為了探索腸道細菌、糞便代謝物和血糖值變化之間潛在的相互作用，基於Spearman相關分析構建了一個共生網路。我們發現，來自腸桿菌科和乳螺科的細菌OTUS與碳水化合物和氨基酸代謝相關的糞便和尿液代謝物形成了很強的共生關係（圖5）。與碳水化合物代謝相關的代謝物與與氨基酸代謝相關的代謝物也具有很強的相關性。例如，海藻糖與碳水化合物和氨基酸代謝物廣泛相關，是這個共表達網路中兩條代謝途徑之間的重要節點。其他代謝物和細菌Lachnospiraceae_OTU247與妊娠12周的空腹血糖（FBG）和妊娠24~28周的OGTT血糖呈正相關。這些發現表明，腸道微生物和宿主代謝物的改變在妊娠期糖尿病中形成了協同和節點共存網路（圖5）。
圖5 由妊娠期糖尿病患者與HCS患者不同細菌OTU、糞便和尿液代謝物的相對丰度以及血糖值構成的共生網路。節點的大小表示這些變數的摺疊變化（GDM相對於HC）。紅點和藍點分別表示妊娠期糖尿病受試者相對於HCS變數的相對丰度增加和減少。節點之間的邊緣表示Spearman的負（淺藍色）或正（淺紅色）相關性，邊緣厚度表示p值的範圍（p<0.01）。縮寫：空腹血糖，FBG；口服葡萄糖耐量試驗，OGTT。
7 微生物和代謝標誌物能較高準確率區分GDM和HC。
隨機森林分析被用來探索微生物和代謝標誌物是否可以用來區分GDM和HCs。研究發現，關鍵細菌OTU、尿液代謝物或糞便代謝物的單個標誌板可以區分妊娠期糖尿病和HC，曲線下面積（AUC值）在0.843到0.907之間（細菌：腸桿菌科_OTU123和腸球菌科_OTU253，AUC值=0.858；尿代謝物：海藻糖和3-脫氫莽草酸，AUC值=0.907；糞便代謝物：5-羥基吲哚乙酸和纈氨酸，AUC值=0.843。此外，還發現由這六個生物標誌物組成的組合標記小組比單獨使用任何一個小組都能更有效地區分妊娠期糖尿病和HC（AUC=0.957）（圖6b）。本研究還計算了這種聯合標記物的陽性預測值和陰性預測值，因為這些診斷敏感性和特異性指標通常用於臨床實踐。結果發現，該組合標記板可以區分妊娠期糖尿病和肥厚性心臟病，陽性預測值為82.6%，陰性預測值為94.7%。這些標記板的診斷效能也透過10倍交叉驗證進行了驗證（圖6a-b），證實了它們對GDM診斷的普適性。
圖6 區分妊娠期糖尿病患者和HC的微生物和代謝標誌物。（a）隨機森林分析用於量化生物標誌物面板的診斷效能。單項標誌物組合可區分妊娠期糖尿病和慢性丙型肝炎患者。（b）包括這6個標記物的組合標記物比單獨的微生物或代謝標記物具有更強的診斷效能。括號中的正確率是透過10次交叉驗證計算出來的；誤差值反映了正確率的標準差。
結論
在這項研究中，檢測了GDM和HC孕婦的腸道微生物群組成，以及糞便和尿液代謝組學。進一步分析了腸道微生物和代謝物之間的相關性，以及臨床指標。發現妊娠期糖尿病患者具有豐富的淋巴螺旋菌、枯竭的腸桿菌科和反芻球菌科，以及大便和尿液氨基酸和碳水化合物代謝紊亂的特點。結果表明，妊娠期糖尿病患者的臨床表現為淋巴螺旋菌豐富，腸桿菌科和反芻球菌科減少，大便氨基酸和碳水化合物代謝紊亂。此外，腸桿菌科和羊肚菌科的細菌OTUS與幾種與宿主碳水化合物代謝有關的代謝物形成了很強的共生關係。此外，本研究還鑑定了一種新的組合標記板，可以高精度地區分GDM個體和HCS個體。本項研究發現提示腸道微生物區系紊亂可能透過調節宿主的氨基酸和碳水化合物代謝而參與GDM的發病，為理解GDM的基礎提供了一條新的途徑。