一
歐洲、美國指南對HPV mRNA與p16的定位
（一） “Whereas HPV DNA tests detect the presence or absence of HPV virus genomes, HPV RNA tests are designed to detect the expression (mRNA) of genes that are related to cancer development. Overexpression of HPV E6 and E7 viral genes is required for malignant transformation. Detection of mRNA of E6 and E7 genes may allow a distinction between transient infections and those that will progress to cancer”
“HPV DNA檢測的是HPV病毒基因組是否存在，而HPV RNA檢測方法被用來檢測與癌症進展相關基因的表達（即mRNA）。HPV E6和E7病毒基因的過表達是惡性轉化的必要條件。檢測E6和E7基因的mRNA可以區分一過性感染者及那些能夠進展為癌的患者。”
——European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening，Second edition - Supplements
（二） “Approved assays include target-and signal-amplification assays of HPV DNA, as well as HPV mRNA.”
“推薦HPV檢測方法包括HPV DNA和HPV mRNA的靶標擴增和訊號擴增。”
——2019 ASCCP Risk-Based Management Consensus Guidelines for Abnormal Cervical Cancer Screening Tests and Cancer Precursors
（三）“Immature squamous metaplasia and atrophic squamous epithelium are documented sources of misinterpretation and may be mistaken for CIN1-2 (Crum et al., 1983). In such cases p16 staining and repeat biopsy after oestrogen may be helpful (Klaes et al., 2002, see also section 5.6).”
——European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening，Second Edition
（四）“A positive p16 immunostain supports the diagnosis of histologic HSIL if the morphological assessment of H&E slides is consistent with CIN 2 or CIN 3. There is a risk of overcalling cervical histology results when p16 is used incorrectly. Most importantly, a morphologic CIN 1 on H&E should not be upgraded to histologic HSIL (CIN 2) even if p16 positive”
“HSIL治療的管理也將CIN2和CIN3的管理方案根據不同風險進行推薦，並繼續推薦p16免疫組織化學在HSIL（CIN2或CIN 3）組織形態學的應用。但應避免p16應用不當，造成宮頸組織學過度診斷的風險，例如組織形態為CIN1，即使p16陽性也不應升級為HSIL（CIN2）。”
——2019 ASCCP Risk-Based Management Consensus Guidelines for Abnormal Cervical Cancer Screening Tests and Cancer Precursors
二
歐洲、美國指南對HPV mRNA與p16診斷效能的評價
（一）“Nevertheless, lower proportions of mRNA-positive results were observed in normal cases, ASCUS, and LSIL, which could be interpreted as a possible increase in specificity compared to HPV DNA testing.”
“雖然，與HPV DNA檢測相比在正常、ASCUS和LSIL中觀察到的mRNA陽性結果比例較低，但其特異性有所增加。”
——2019 ASCCP Risk-Based Management Consensus Guidelines for Abnormal Cervical Cancer Screening Tests and Cancer Precursors
（二）“Immunostaining for molecular markers of proliferation or regulation of the cell cycle, such as standardized detection of p16-INK4A overexpression with or without other markers (such as Ki-67), has been shown to be very sensitive for determining the severity of dysplasia.”
“細胞增殖或細胞週期調控分子標記的免疫染色，如p16-INK4A的過量表達，其他標記物是否存在如Ki67，已被證明對檢測異型增生具有較高的敏感性。”
——European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening，Second edition - Supplements
三
HPV mRNA與p16的概述
研究發現，高危人乳頭瘤病毒（High risk human papillomavirus，HR-HPV）感染宿主細胞後，誘導細胞發生一系列分子表達和功能的改變，繼而發生形態學改變。因此，人們設想透過對這些分子變化的檢測來幫助篩查子宮頸癌，從而更有效地提高癌前病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡轉診。
01 HPV E6/E7 mRNA
HPV是一種屬雙鏈閉環的球形小DNA病毒，在惡性腫瘤中，HR-HPV DNA首先與宿主細胞內的染色體整合，然後表達病毒E6、E7癌基因轉錄形成E6/E7 mRNA，進一步翻譯形成 E6、E7蛋白，E6和E7蛋白可以降解pRb 蛋白使宿主細胞進入S期，使病毒不斷複製，同時E6蛋白可以降解p53 蛋白，逃避凋亡，使細胞分裂不受控制，導致基因組不穩定的發生。E6/E7 mRNA為腫瘤的發生提供了前提條件，其表達水平與宮頸病變的進展程度及細胞的惡性轉化關係十分密切[1]。
02 p16
p16基因位於人類的第9號染色體短臂2區1帶（9p21）上，是20世紀90年代Kamb等[1]發現的可介入到細胞分裂週期的抑癌基因，其抑癌作用的主要途徑為在細胞內參與細胞有絲分裂調控，主要表現為參與細胞週期的啟動和不同細胞週期之間的轉換。p16 在生物學組織中廣泛存在，Kamb等[2]已從多種惡性腫瘤組織中檢測出50%以上的p16基因純合子缺失、無義錯義、移碼突變等，而在宮頸癌中p16基因並未表現為類似以上的基因異常現象，而是表現為表達量的明顯增高。國內外對這一現象研究發現，p16的異常表達與HPV16、HPV18型感染密切相關，且其異常表達在CIN1、CIN2、CIN3至子宮頸SCC的演進過程中出現逐漸升高的狀態[3]。
03 p16，HPV E6/E7 mRNA檢測用於診斷宮頸病變的相關研究
p16陽性表達與HR-HPV感染呈正相關，p16高表達與HPV的致癌活性呈正相關。E6蛋白與p16表達強度的相關性在CIN2中最強，以強陽性表達最為顯著，提示兩者可能存在某些內在關聯。對p16和HPV16/18 E6蛋白診斷CIN2+的敏感性及特異性進行了比較，結果提示兩者呈陽性表達時E6蛋白對CIN2+的診斷效能最佳，p16的敏感性高於E6蛋白，但特異性低於E6蛋白。HPV的一過性感染不會影響細胞週期調控。HPV持續感染可導致p16蛋白髮生轉化，HPV E7蛋白透過滅活Rb減弱對p16的抑制作用。HPV持續感染後，細胞內p16過度表達。p16- CDK-Rb串聯體在HPV感染患者體內可以競爭特異性結合而失活，阻斷後續細胞G-S期的轉化及合成DNA的啟動，造成宮頸組織的永生化病變[3]。
Areán-Cuns等[4]透過對1865位HPV陽性婦女進行檢測並與細胞學p16/Ki-67雙染色檢測比較，認為HPV E6/E7 mRNA比p16/Ki-67出現的時間要早，尤其在宮頸病變比較輕的組織中表現明顯，而宮頸病變發展到比較嚴重的HSIL和宮頸癌病變中，兩個生物學指標幾乎能同步表達在病變組織中[3]。雖然p16/ki-67雙染檢查能顯著提高診斷準確性，然而在低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)和意義不明確的非典型鱗狀上皮(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)人群中進行危險分層的結果卻不盡如人意，尤其是在長期的臨床觀察過程中[5]。
篩查子宮頸癌前病變對於早期治療和預防子宮頸癌具有重要價值。p16檢測對於宮頸癌前病變“過渡性”“模糊性”診斷的進一步明確起到良好的輔助作用，E6/E7 mRNA檢測能夠評估宮頸癌前病變進一步的風險，臨床診斷過程中尋找到一種或數種適宜的生物標誌物，既能夠最佳化現有的篩查方法從而提高診斷的特異度和靈敏度，亦能防止過度治療帶來的不必要的損傷及醫療資源的浪費。
[1]李明秀,劉志強,等.人乳頭瘤病毒E6/E7基因在宮頸癌發展過程中作用機制的研究[J]. 中國當代醫藥,2020,27(16):23-26,30.
[2]Kamb A. Cyclin-dependent kinase inhibitors and human cancer[ J]. Curr Top Microbiol Immunol, 1998, 22(7): 139-148.
[3]曹潔瓊, 王曉宇, 趙燁. p16,E6/E7蛋白與宮頸癌及癌前病變相關性的研究進展[J]. 臨床與病理雜誌, 2020(2).
[4] Areán-Cuns C, Mercado-Gutiérrez M, Paniello-Alastruey I, et al. Dual staining for p16/ki67 is a more specific test than cytology fortriage of HPV-positive women[ J]. Virchows Arch, 2018, 473(5): 599-606.
[5]Peter, Ziemke, Katrin, et al. Predictive Value of the Combined p16 and Ki-67 Immunocytochemistry in Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions.[J]. Acta Cytologica, 2014.
END