責編 | 酶美
鼻咽癌是來源於鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，好發於中國南方，尤其在廣東地區其發病率最高，素有“廣東瘤”之稱。近年來隨著放化療技術的進步，鼻咽癌患者的總體生存率得到提高，但超過10%的患者最終發生復發轉移。針對表皮生長因子受體和免疫檢查點阻斷等靶向和免疫治療顯示出一定效果，但大部分腫瘤呈現治療抗拒，患者未能受益。患者不同的臨床症狀和治療結局說明了鼻咽癌的異質性體現。針對腫瘤細胞，以往研究利用遺傳學、EB病毒感染和腫瘤基因組手段揭示了鼻咽癌異質性的分子基礎，然而，針對於腫瘤微環境中大量浸潤的非腫瘤細胞對鼻咽癌的生物學貢獻欠缺全面瞭解。
2021年2月2日，中山大學腫瘤防治中心貝錦新教授、曾益新院士和北京大學生物醫學前沿創新中心張澤民教授在Nature Communications發表題目為“Tumour Heterogeneity and Intercellular Networks of Nasopharyngeal Carcinoma at Single Cell Resolution”。 研究報道了鼻咽癌腫瘤微環境的細胞異質性組成及其動態變化，對發現鼻咽癌患者的治療抵抗機制和新的診治靶點具有重要的意義。
鼻咽癌腫瘤微環境以EB病毒感染腫瘤細胞和大量免疫細胞的浸潤為主要特點。該團隊利用10x Genomics 5' 單細胞轉錄組和免疫組庫（VDJ）測序技術解析鼻咽癌腫瘤微環境的異質性，依靠腫瘤和外周血配對的實驗設計，利用生物資訊學分析方法，詳細刻畫了鼻咽癌患者病人外周血與腫瘤內T細胞克隆狀態，追蹤鼻咽癌患者外周血與腫瘤內免疫細胞動態遷移、變化的過程，並且透過生存分析、多色免疫組化和其他單細胞轉錄組資料集驗證了重要的發現（圖1）。
圖1整體研究設計
該研究利用每個細胞的表達圖譜，揭示了鼻咽癌患者外周血和腫瘤組織中的異質性程度，包括細胞型別、組分差異、T細胞的多種功能狀態。透過構建T細胞受體(TCR)序列,確定了鼻咽癌中不同的T細胞克隆亞型、擴增分佈、遷移和轉化能力。透過偽時間序列分析和根據TCR序列的保守性，研究者發現腫瘤內耗竭的CD8+T細胞和發揮免疫抑制的調節性T細胞可能分別來源於外周血中的CX3CR1+CD8+T細胞和幼稚的調節性T細胞。CX3CR1+CD8+T細胞不僅具有高細胞毒性和高遷移能力，並且與腫瘤內浸潤的CD8+T細胞共享大約10%的TCR克隆型。這些結果說明，CX3CR1+CD8+T細胞具有潛在滲透進入腫瘤組織的能力，並且可以透過TCR識別殺傷腫瘤細胞。這些結果亦提示潛在的細胞治療策略，即可以透過在體外擴增鼻咽癌病人外周血中的CX3CR1+CD8+T細胞亞群，再回輸到病人體內進行細胞治療；或者利用CX3CR1修飾T細胞來增強T細胞的遷移和進入腫瘤的能力。
研究者鑑定了一群在腫瘤內普遍存在的、成熟的LAMP3+樹突狀細胞（圖2）。LAMP3+樹突狀細胞高表達CD274（PD-L1）、PDCD1LG2（PD-L2）、CD200、IDO1等分子，這些分子被認為與免疫調節和免疫耐受相關（圖2）。透過偽時間序列和轉錄因子分析，研究者構建了鼻咽癌病人外周血與腫瘤微環境之間樹突狀細胞的遷移、分化和轉錄因子調控網路，發現了KDM2B、KLF6、NFKB1、TRAFD1、HMGN3和JUN等轉錄因子對促進LAMP3+樹突狀細胞的成熟，降低抗原呈遞能力和增強免疫調節能力至關重要（圖2）。透過靶向這些轉錄因子可能會使LAMP3+樹突狀細胞重塑為正常的抗原呈遞表型，從而使LAMP3+樹突狀細胞在鼻咽癌患者體內重新發揮啟用免疫的功能。
圖2樹突狀細胞的表達譜，分化發育、遷移軌跡和轉錄因子調控網路
EB病毒感染是鼻咽癌在流行地區的關鍵特徵，其在鼻咽癌腫瘤發生和發展中起著重要作用。研究者發現鼻咽癌腫瘤細胞EB病毒相關基因的表達模式存在異質性，與EBV-腫瘤細胞相比，EBV+腫瘤細胞表現出獨特的轉錄狀態，主要表現為激活了與EB病毒進入宿主相關的基因以及與癌症相關的通路，例如NF-κB和Notch通路。此外，訊號通路的結果顯示：EBV-腫瘤細胞與EBV+腫瘤細胞的細胞凋亡和增殖特性相反，EBV-腫瘤細胞其凋亡減弱，細胞增殖能力增強。結合細胞週期的特徵與鼻咽癌病人的預後呈負相關，EBV-腫瘤細胞可能與鼻咽癌腫瘤復發和轉移相關。這種EB病毒表達差異與鼻咽癌腫瘤細胞體外培養丟失EB病毒的現象是否存在一定的聯絡以及對於針對EB病毒的T細胞治療鼻咽癌療效影響值得深入探討。
浸潤的免疫細胞和腫瘤細胞不是獨立和靜態存在，而是在腫瘤微環境中經歷複雜而動態的相互作用，從而共同促進了腫瘤的進展。研究者利用受體-配體相互作用分析發現：LAMP3+樹突狀細胞透過CCL17-CCR4和CCL22-CCR4招募外周血中的調節性T細胞進入腫瘤。TNFRSF4+調節性T細胞高表達的CTLA4、ENTPD1和CSF1等免疫抑制分子，與LAMP3+樹突狀細胞上CD80/CD86、ADORA2A和SIRPA分子結合。同時，LAMP3+樹突狀細胞還可以透過PDL1-PD1和CD200-CD200R訊號影響耗竭的CD8+T細胞，這分別是抑制抗腫瘤反應的經典和非經典免疫抑制途徑。該研究揭示了鼻咽癌中LAMP3+樹突狀細胞，調節性T細胞和耗竭的CD8+T細胞之間的相互作用網路，表明多種免疫細胞之間的潛在串擾可促進鼻咽癌腫瘤微環境免疫抑制機制的形成。綜上所述，LAMP3+樹突狀細胞和調節性T細胞在鼻咽癌中發揮較強的免疫抑制作用，未來可聯合作為鼻咽癌治療靶點。
研究者觀察到EBV+腫瘤細胞比EBV-腫瘤細胞與免疫細胞具有更廣泛的受體-配體相互作用。EBV+腫瘤細胞在腫瘤中獨特表達CX3CL1，根據受體-配體相互作用分析結果：它會與外周血中免疫細胞（包括CD8+T細胞、樹突狀細胞、NK細胞和單核細胞）表達的CX3CR1相互作用，表明EBV+腫瘤細胞對外周血免疫細胞具有趨化潛力。此外，研究者觀察到EBV+腫瘤細胞上的EGFR被認為與多種細胞型別上的TGFB1結合，其他研究報道它可調節EB病毒的生命週期。研究者還觀察到多種細胞型別透過TNF-NOTCH1和JAG2-NOTCH2與EBV+腫瘤細胞相互作用，進而導致EBV+腫瘤細胞下游Notch通路的啟用，這可能與鼻咽癌腫瘤細胞的放射敏感性和腫瘤乾性有關。EB病毒的感染塑造了鼻咽癌腫瘤微環境內大量免疫細胞浸潤的特點，靶向EB病毒的治療方式也是鼻咽癌治療研究的熱點之一。結合研究者發現的多病人間共有的識別EB病毒抗原的CDR3序列（CASSFSGANVLTF），該研究為後續研究者探討靶向EB病毒感染為鼻咽癌防治策略提供了一份高解析度和多組學的參考資料。
圖3鼻咽癌患者外周血與腫瘤微環境中免疫細胞遷移、轉化和腫瘤細胞相互作用的示意圖
總之，該研究利用單細胞轉錄組測序技術，透過高解析度解析鼻咽癌腫瘤微環境的異質性，鑑定了對鼻咽癌腫瘤發生過程中重要的細胞亞群和分子（圖3），從而提供了對鼻咽癌致病機制和潛在治療策略的獨特見解。
中山大學腫瘤防治中心劉洋和何帥（博士生）、北京大學生物醫學前沿創新中心王西亮（博士後）為共同第一作者。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-21043-4