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南昌大學食品學院張國文教授團隊在Food Chemistry上線上發表了文章《Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid》,該文系統地研究了表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯與酪氨酸酶的結合特性、對酪氨酸酶的抑制機制及其與曲酸的聯合抑制效應,研究結果對預防和治療色素沉著性面板病以及控制果蔬的酶促褐變具有重要的理論意義和實用價值。該文將於Food Chemistry 2021年7月1日刊出。張國文教授為本文通訊作者。

Highlights

* 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)以混合型方式可逆地抑制酪氨酸酶;

* EGCG與GCG聯合使用對酪氨酸酶有協同抑制作用;

* 疏水作用和氫鍵主導了結合過程;

* EGCG和GCG均結合到酪氨酸酶的活性中心;

* EGCG和GCG的結合可誘導酪氨酸酶的構象伸展。

Introduction

酪氨酸酶(tyrosinase,TY)是黑色素產生的關鍵酶,在控制食物褐變和色素沉著性面板病中發揮重要作用。當TY過量存在或其活性過高時,黑色素可能會過度表達和聚集,從而導致面板疾病、食物褐變和蝦黑變病等。抑制TY的催化活性,阻止酪氨酸氧化為黑色素並減少黑色素的產生已成為預防和黑色素沉著性面板病和控制食品酶促褐變的主要途徑。茶是世界著名的三大飲料之一,在國外享有“健康之液,靈魂之飲”的美名,在我國被譽為“國飲”,飲茶有益健康。兒茶素是一類多酚化合物,是茶多酚的主體成分,約佔茶多酚總量的65%~80%,也是茶葉中有保健功能的主要成份之一。近年來,有研究表明,兒茶素EGCG和GCG對TY具有良好的體外抑制活性,但共抑制TY的分子機制尚不明確,限制了兒茶素作為天然TY抑制劑的應用研究。南昌大學食品學院張國文教授團隊系統地研究了EGCG和GCG與TY的結合特性、對TY的抑制機制及其與曲酸的聯合抑制效應,研究結果對預防和治療色素沉著性面板病以及控制果蔬的酶促褐變具有重要的理論意義和實用價值,同時為兒茶素的膳食營養提供實驗依據。

Results and Discussion

EGCG和GCG對TY的抑制作用

EGCG和GCG均呈現濃度依賴性地抑制TY活性,其半數抑制濃度IC50值分別為39.4 ± 0.54 μM和36.8 ± 0.21 μM(圖1)。EGCG和GCG是具有多個羥基的典型多酚化合物,這些結構非常有利於與TY的氨基酸殘基產生氫鍵,從而促進兒茶素與TY的結合,降低TY的催化能力。EGCG和GCG均以混合方式可逆地抑制TY活性,它們透過與底物競爭結合到TY的活性中心而抑制酶的活性。GCG在反式構象中包含一個兒茶酚基團,這可能導致與大分子或溶劑相互作用的耐受性和靈活性增加,從而有助於其對TY的抑制。

EGCG、GCG與曲酸對TY的聯合抑制作用

與EGCG、GCG單獨抑制TY活性相比,EGCG與曲酸的聯合使用抑制作TY的能力減弱,而GCG與曲酸聯用、EGCG與GCG聯用對TY的抑制作用增強(圖2)。推斷EGCG與曲酸聯用對TY的抑制為拮抗作用,GCG與曲酸聯用對TY的抑制為加和作用,而EGCG與GCG聯用能夠協同抑制TY。

EGCG、GCG與TY的結合特性

結果表明,EGCG、GCG均能透過與TY形成基態複合物而靜態猝滅TY的內源熒光,在相同溫度下,GCG顯示出更強的熒光猝滅能力(圖3)。EGCG和GCG在TY上存在1個結合位點,但GCG與TY的結合常數值高於EGCG,表明GCG更容易與TY結合,這歸因於兒茶酚基團的順、反式構象的差異,導致GCG的空間位阻小於EGCG。熱力學分析結果表明,疏水作用力和氫鍵在EGCG / GCG-TY複合物的形成和穩定中發揮重要作用。

EGCG和GCG對TY的構象的影響

同步熒光光譜表明,EGCG和GCG均未顯著影響Tyr和Trp殘基的疏水性和極性,EGCG與TY的結合位點更接近Tyr殘基,而GCG與TY的結合位點更接近Trp殘基。圓二色譜結果表明,隨著EGCG或GCG的加入,TY的二級結構含量發生明顯變化(圖4),當EGCG與TY的摩爾比從0:1增加到8:1, GCG與TY的摩爾比從0:1增加到1:1時,EGCG和GCG分別引起TY的α-螺旋含量從(32.16 ± 0.65)%減少到(29.69 ± 0.63)%和從(27.62 ± 0.20)%下降到(23.44 ± 0.96)%,而導致b-摺疊含量則分別從(21.73 ± 0.22)%增加到 (24.92 ± 0.13)%和從(24.74 ± 0.81)% 增大到 (29.84 ± 0.32)%,EGCG或GCG與TY結合導致酶結構部分伸展。與EGCG相比,GCG誘導TY結構發生更明顯的變化,這可以解釋為什麼GCG具有比EGCG更強的TY抑制能力。

分子對接研究

分子對接結果顯示,EGCG透過疏水作用力與氨基酸殘基His244、Val248、His263、Ser282和Val283相互作用,極性溶劑化自由能在總自由能中佔很大比例,EGCG中A環上C5–OH(H)及D環上C11′–OH(H)分別與TY中His85(O)和Met280(O)形成兩個氫鍵。GCG被His61、His85、Gly86、His244、Val248、His259、His263、 Arg268、Val283和Glu322殘基包圍,且觀察到四個氫鍵(圖5)。此外,His244、Val248和Val283參與疏水相互作用的形成,基於分子力學/泊松-玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)的自由能分解分析,結果表明極性溶劑化自由能對總自由能的貢獻最大。氫鍵和疏水相互作用在穩定EGCG/GCG-TY複合物的結構中起著重要作用,這與熒光滴定實驗結果一致。重要的是EGCG和GCG均與銅離子相互作用,而His61、His85、His244、His259和His263均位於TY的活性中心,可以進一步證明EGCG和GCG可能佔據了活性中心底物的位點,透過扭轉多肽鏈的結構改變了TY的構象,從而破壞了酶活性位點阻止底物被TY催化,最終抑制酶的催化活性。

分子動力學模擬

分子動力學模擬進一步評估了EGCG/ CG-TY複合物的結構和性質。圖6顯示,與EGCG或GCG結合後,EGCG/GCG-TY複合物的波動減少,酶的穩定性增強。EGCG與TY結合,使得TY結構變得疏鬆,但在GCG-TY結合中未觀察到類似的影響。TY和EGCG/GCG–TY複合物之間的均方根漲落差異不明顯,但是包括60-90, 240-260 and 280-290處氨基酸殘基顯示明顯的波動,證明氨基酸殘基高靈活性是引起高均方根漲落值的主要原因,但酶與抑制劑之間的相互作用也會影響均方根漲落值。EGCG和GCG的存在對TY中的溶劑可及性表面積沒有明顯影響。分子動力學模擬結果支援了上述實驗結果。由於EGCG或GCG與TY之間的相對位置不斷變化,因此,EGCG與TY之間的氫鍵數量增加且在0至7之間變化。而從一開始在GCG和TY之間就產生氫鍵,並且氫鍵的數量逐漸增加並在0和6之間變化。這些結果進一步證實了分子對接的結果,表明氫鍵在EGCG或GCG與TY之間的相互作用中起著重要作用。

Conclusions

EGCG和GCG都以較好的TY抑制活性,其抑制型別為混合型,EGCG和GCG聯合使用對TY顯示出協同抑制效應。疏水作用力和氫鍵促進了EGCG和GCG與TY的自發結合,並導致TY內源熒光產生靜態猝滅。EGCG和GCG的存在對TY中Tyr和Trp殘基的微環境沒有顯著影響,但誘導了α-螺旋含量的減少和b-摺疊含量的增加,從而導致TY結構的伸展。分子對接結果表明,EGCG、GCG透過疏水力和氫鍵與TY活性空腔中的氨基酸殘基相互作用。氨基酸自由能分解的分析證明,疏水力在EGCG或GCG與TY的結合中起主要作用。分子動力學模擬表明氫鍵起到穩定複合物構象的作用。EGCG降低了TY結構的緻密性,使TY結構疏鬆。因此,推測EGCG、GCG結合到TY的活性中心並與銅離子和關鍵氨基酸殘基相互作用,佔據底物的位置並引起TY二級結構的改變,從而阻止底物被催化,最終降低TY的活性。該研究為洞察兒茶素防治色素沉著性面板病和食品抗褐變機制提供了理論基礎。

作者簡介

張國文 教授

張國文,博士,二級教授,博士生導師,現任南昌大學食品學院副院長。入選2020年科睿唯安全球“高被引科學家”榜單,江西省“百千萬人才工程”人選,江西省高等學校中青年學科帶頭人,南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室固定成員與學術帶頭人,國家自然科學基金同行評審專家,中國工程教育認證核心專家,江西省食品安全委員會食品安全專家委會委員,江西省食品科學技術學會理事,江西省微量元素與健康研究會理事,Food Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Hydrocolloids、Food & Function、Food Research International、Food and Chemical Toxicology、LWT - Food Science and Technology、Journal of Functional Foods、Analytical Chemistry、Journal of Hazardous Materials、International Journal of Biological Macromolecules等30多家國際學術期刊審稿人。近年來,主持國家自然科學基金、教育部博士點基金、國家重點實驗室基金、江西省重大科技專案等國家和省級科研專案20多項,在國內外高水平學術期刊上發表論文270多篇,其中SCI收錄論文120多篇,H指數36,Web of Science收錄論文總被引3900多次。獲得國家級教學成果二等獎3項,江西省教學成果一等獎2項、二等獎3項,科技部“振華-王賜義科技扶貧獎”,江西省自然科學三等獎2項,主編教材4部。

宋欣 碩士研究生

宋欣,女,南昌大學食品學院2018級碩士研究生,研究方向為功能食品與營養。在國內外學術期刊發表論文3篇,其中SCI論文2篇,包括在Food & Function上發表封面論文《Inhibitory mechanism of epicatechin gallate in tyrosinase: inhibitory interaction, conformational change and computational simulation》和在Food Chemistry上發表論文《Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid》。

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