牛血清作為生物製品生產所需的一種原材料，其質量的好壞直接影響生物製品的質量及安全性。雖然細胞大規模培養及減少動物來源成分在生物製品中的使用已成為今後生物製藥發展的趨勢，但是，正如USP 40中對牛血清的介紹，目前無血清技術還有許多問題尚未攻克，使用新增血清的培養基可以減少研發任何型別新細胞系（株）的所需時間，從而容易得到最最佳化的培養基配方，因此牛血清在細胞培養領域仍然佔有非常重要的地位，本章節主要介紹含血清的細胞培養。
一、美國藥典<1024>牛血清相關介紹
美國藥典<1024>牛血清相關介紹
牛血清是從牛（黃牛或其他品種）血液中去除細胞、纖維蛋白和凝血因子後得到的液體。自從現代細胞培養技術出現以來，生物製品的生產廠家廣泛使用牛血清作為細胞培養生長的補充物。
血清中富含的蛋白質、生長因子、激素、氨基酸、維生素、糖類、脂類、微量元素等營養成分能支援細胞培養，並得到了廣泛應用。在疫苗、天然提取及重組生物製劑(以下簡稱生物製品)、組織工程和其他新興細胞治療等人用或獸用的研究和工業化製造也得到應用。胎牛血清主要應用於科研，小牛血清(來自新生和稍大的動物)的使用頻率要低得多，但由於其成本較低，也許更多是在商業化生產上廣泛的應用。
與其他動物源性產品的情況一樣，牛血清可能存在將外源因子帶入細胞培養中的風險。血清製造商和監管機構必須採用嚴格的採購和檢測程式，以嚴格的加工和生產指導方針確保牛血清的質量。
為了提高牛血清生物製品生產的質量和安全性，也為了減輕監管負擔，科研人員開始研究牛血清的替代品，從而有了專用的無血清培養基配方的構想。雖然人們認識到，在選擇使用無血清培養基時，應避免使用牛血清，但在有些技術上是不可能的或不切實際的。
二、 牛血清在細胞培養中的應用
1、牛血清與細胞培養基
細胞培養基是培養環境中最重要的成分，由培養基和牛血清混合組成的完全培養基能夠提供細胞生長所必需的營養素、生長因子和激素，並能調節培養體系的 pH 值和滲透壓。 目前主要有三種培養基，即基礎培養基、低血清培養基和無血清培養基，三者對血清新增量的要求不同。
基礎培養基：大多數細胞系均可在基礎培養基中生長良好，基礎培養基中含有氨基酸、維生素、無機鹽和碳源 (如葡萄糖)，但是這種基礎培養基配方中必須新增血清。低血清培養基：低血清培養基是一種補充了營養素或部分血清替代物從而降低了血清需要量的基礎培養基，能減少血清對細胞培養實驗的不良效應。無血清培養基：無血清培養基 (SFM) 是透過用適當的營養和激素成分代替血清的一種培養基，避免使用動物血清帶來的問題。2、牛血清在細胞的貼壁與懸浮培養中的應用
目前主要有兩種基本的細胞培養體系，一種是使細胞在人工基質上單層生長 ，即貼壁培養、微載體、片狀載體等培養方式，另一種是使細胞在培養基中自由漂浮生長，即懸浮培養，其中包括全懸浮培養和需要藉助載體的培養。除造血細胞系和其他一些細胞外，大多數脊椎動物細胞均具有貼壁依賴性，必須在合適的基質上培養，且該基質必須經過特殊處理，以便細胞粘附和伸展 (即組織培養處理)。但是，許多細胞系也可採用懸浮培養。
牛血清在兩種培養體系中發揮的作用有所區別，如貼壁培養血清主要提供貼壁因子和營養物質，而懸浮培養則主要提供促細胞生長的因子。下表彙總了兩種培養方式的特點：[5]
貼壁培養
懸浮培養
全懸浮培養
載體培養
適合包括原代細胞在內的大多數細胞型別。
適合已適應全懸浮培養的細胞以及其他一些無粘附性的細胞。
適合依賴微載體、片狀載體貼壁的細胞培養。
通常需要新增5%-10%牛血清，個別細胞培養血清用量需高達20%。
含血清培養或無血清培養。
含血清培養（也有無血清微載體培養）。
方瓶、轉瓶培養易於透過倒置顯微鏡觀察細胞密度及形態。
較易傳代，需要經常進行細胞計數和存活率測定，以監測生長情況。
微載體培養可觀察細胞貼在載體上的細胞形態；片狀載體則無法觀察到細胞的實時狀態。
利用酶消化或機械方法解離細胞，通常需要用牛血清終止蛋白酶的消化。
無需透過酶或機械方法解離細胞，細胞損傷較小。
當需要收穫細胞時，方法同貼壁培養。
細胞生長受表面積限制，因而產量受限。
細胞生長受到其在培養基中濃度的限制，易於擴大培養規模。
細胞生長受到載體數量及表面積限制，微載體可以放大規模，片狀載體則很難放大。
需要使用經過組織培養處理的容器。
可使用未經組織培養處理的容器進行培養，但需要攪動 (即搖晃或攪拌) 以便進行充分的氣體交換。
需要微載體或者片狀載體，在生物反應器或其他適合的容器中培養。
對於貼壁依賴性細胞，細胞的貼壁伸展過程在細胞的生長增殖中具有重要的作用。細胞在支援物表面的貼壁過程可分為三步，分別為貼壁因子粘附、細胞開始粘附、細胞進一步牢固附著並伸展。同時細胞形態由圓形變為圓餅形（放射狀鋪伸細胞），並逐漸展開伸展為扁平的極性細胞，這種變化有利於增加細胞與營養環境的物質交換表面積，而且只有當細胞伸展到合適狀況，細胞DNA才開始合成，所以細胞伸展狀況制約了細胞的分裂增殖活動過程。
細胞貼壁伸展的速度，對於貼壁細胞的生長也是重要因素之一。傳代細胞貼壁伸展的越快，細胞進入生長期的時間也就越早，這樣有利於細胞的生長，質量好的牛血清往往含有更多有利於細胞貼壁的因子。（上文中已有介紹）
除此之外，當科研人員將細胞擴增至一定數量後，需讓細胞在容器中維持生存而不擴增時，可調整牛血清在培養基中的濃度，通常濃度約5%（根據實際使用情況需進行調整）。
牛血清在動物細胞懸浮培養的應用中依據細胞是否具有貼壁依賴性，分為動物細胞全懸浮細胞培養和動物細胞微載體懸浮培養。全懸浮細胞（如BHK21懸浮細胞株）可以在生物反應器中直接進行生產增殖，具有細胞自由生長、培養環境均一、取樣簡單、培養操作簡單可控、放大方便、汙染率和成本低的特點。貼壁細胞（ST、Vero細胞等）在生物反應器中懸浮培養時需要藉助介質表面，通常是微載體，其細胞所能達到的濃度和生產產品的產量依賴於微載體提供的生長表面積。微載體為動物細胞生長提供了便利的表面，具有極大的培養表面積/體積比，它能夠實現細胞高密度培養，是目前貼壁動物細胞大規模培養使用的主要介質。
在懸浮培養中，生產抗體藥物的CHO細胞、生產流感（禽流感）疫苗的MDCK細胞等已經採用無血清培養。但在BHK21細胞全懸浮培養的口蹄疫疫苗生產中，牛血清仍然被廣泛使用。在南美和印度，口蹄疫疫苗生產通常新增10%左右成牛血清，而國內企業採用低血清培養基彌補了基礎細胞培養基的不足，但是，牛血清中的一些促細胞生長的成分還是無法被替代，通常會在培養基中新增1%-3%的牛血清，同時它還起著調節培養液酸鹼度的作用。為使培養體系保持良好的混合狀態和分散性，從而提高細胞生長量，需對培養體系進行攪拌，這時培養基中的牛血清即可以降低細胞的機械損傷。總而言之，牛血清因有著細胞生長必須的營養成份，所以具有極為重要的功能。
三、牛血清在大規模動物細胞培養（工業疫苗）中的應用及常見問題
1949年，恩德斯、托馬斯哈克韋爾和弗雷德裡克查普曼羅賓斯在《SCIENCE》雜誌上報告了一種動物病毒的體外培養——脊髓灰質炎病毒（Cultivation of the Lansing Strain of Poliomyelitis Virus in Cultures of Various Human Embryonic Tissues）。這是第一篇關於在細胞培養中生長病毒的報告，開拓了以動物病毒為研究物件的新領域，為以後採用細胞培養技術生產疫苗奠定了基礎[9]，這三名科學家因此獲得1954年諾貝爾生理學或醫學獎。
早在1962年，P.B.Capstick, R.C.Telling等科學家在《Nature》上發表了關於BHK細胞懸浮培養以及其對口蹄疫病毒的敏感性的報道，當時細胞培養採用了Eagle’s基礎培養基+10%成牛血清（Bovine Serum）+10%TPB（胰蛋白腖磷酸鹽肉湯/Tryptose Phosphate Broth）[10]。
1965年，R. C. TELLING等科學家發表了《Submerged Culture of Hamster Kidney Cells》 ，文中介紹了BHK-21細胞懸浮培養所用的裝置及培養基。[11]
目前牛血清已廣泛應用於大規模細胞培養，由於新生牛血清相對於小牛血清具有更好的細胞培養效果，且能接近胎牛血清，因此疫苗生產等大規模的生產型企業會優先考慮經濟且細胞培養效果較好的新生牛血清。胎牛血清通常用於對培養條件要求較高的細胞。
但由於成牛血清價格遠低於新生牛血清，且在疫苗產業發展初期已有成牛血清應用的先例，因此在印度及南美等地區國家將去除抗體的成牛血清應用於疫苗生產，如口蹄疫等獸用疫苗領域[12][13]。成牛血清不僅可以應用於細胞培養，在病毒培養中也起到了重要作用。2010年，L. Robinson 等人發表關於BHK-21細胞口蹄疫疫苗研究的文獻《Foot-and-Mouth Disease Virus Exhibits an Altered Tropism in the Presence of Specific Immunoglobulins, Enabling Productive Infection and Killing of Dendritic Cells》，文中就提到了採用GMEM+1%成牛血清的病毒培養方式。[14]
用於現代生物製品生產的細胞主要有以下幾類：
原代細胞
傳代細胞
傳代細胞是可在體外連續傳代的細胞系，理論上具有無限傳代的壽命，傳代細胞系可以透過多種方法衍生而來。如Vero細胞、BHK21細胞、CHO細胞、Namalva細胞、雜交瘤細胞株、MDCK細胞等。
二倍體細胞
二倍體細胞是指能夠在一定細胞週期（即一定代次範圍內進行有限傳代）培養的細胞株，它們的細胞核染色體在一定代次數內仍然是二倍數的，2n細胞佔80%以上。例如人二倍體細胞（HDCs）來源於正常人體組織（一般來源於人類胚胎肺、腎等組織）建立的細胞株，可進行體外傳代培養，但具有一定的傳代壽命（一般只能傳代培養50-100代），如2BS細胞、KMB-17細胞、MRC-5細胞等。
由於使用原代細胞生產疫苗需用大量動物，每次使用時需要從頭製備，並且不能完全排除外源因子汙染可能，批間差異大，質量難以控制；人二倍體細胞製備條件要求較高、生產成本昂貴，限制了疫苗的推廣使用；而傳代細胞具有無限增殖能力，具有繁殖速度快，維持時間長，建立供疫苗使用的細胞庫後容易控制外源因子汙染等優點，是疫苗生產的理想基質，非常適宜於生物反應器大規模培養。
含血清培養的細胞與疫苗產品舉例
細胞型別
細胞名稱
人用疫苗舉例
原代細胞
金黃地鼠腎細胞
乙腦、出血熱、狂犬病疫苗
雞胚成纖維細胞
麻疹疫苗
牛腎細胞
輪狀病毒疫苗
人二倍體
MRC-5
風疹疫苗、水痘疫苗、狂犬病疫苗
2BS
甲肝、水痘、風疹疫苗
KMB17
甲肝疫苗
傳代細胞
Vero
狂犬病、乙腦、出血熱、EV71、IPV
細胞型別細胞名稱
獸用疫苗舉例
原代細胞
牛睪丸細胞
豬瘟
二倍體細胞
ST
細小病毒、偽狂犬、豬瘟疫苗
傳代細胞
BHK21
口蹄疫、狂犬病、偽狂犬病毒疫苗
Marc145
繁殖與呼吸綜合徵疫苗
MDBK
牛腹瀉病毒疫苗
Vero
豬流行性腹瀉、犬瘟熱疫苗
PK15
細小病、圓環病毒、偽狂犬病毒疫苗
根據動物細胞的型別，可採用貼壁、懸浮培養方法進行大規模培養，通常的疫苗大規模生產工藝包括轉瓶培養、細胞工廠、搖瓶培養、生物反應器懸浮培養等。牛血清不僅提供細胞培養所需的營養成分、生長因子、貼壁因子，在懸浮培養時還起到保護緩衝的作用。為了加強氣--液--固之間的物質傳遞，使培養體系保持良好的混合狀態和分散性，從而提高細胞的生物量和增加生產物的積累，需對培養體系進行攪拌，培養基中的牛血清由於具有一定的粘稠度，可以降低細胞的機械損傷。
由於牛血清是動物源性的產品，在大規模細胞培養中可能產生由血清引起的細胞生長狀態不佳或降低疫苗生產病毒滴度，主要表現在以下方面：
細胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；細胞傳代後形態不正常，細胞狀態發生變化，如輪廓變得模糊，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴充套件生長；細胞傳幾代後就出現脫壁現象，不能連續傳代 ；可能由於質量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力；細胞形態較好，狀態正常，但是接毒後細胞基本不發生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況可能是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體，如果存在這些抗體，就會中和病毒。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體完全中和，無法在細胞中增殖，所以檢測不到病毒滴度。細胞生長狀態一般，產毒少，毒價低。這種情況比較常見，細胞是病毒的載體，由於血清質量不好，導致細胞生長狀態差，病毒就無法進行正常複製，所以造成疫苗效價低，也可能造成不合格產品。為了減少由於血清質量問題對細胞形態及病毒滴度產生的影響，選擇質量較高、批間差異較小的牛血清就變得至關重要。所以血清使用者需選擇向有正規生產經營資質、有完善質量、售後服務體系、可靠技術支援的品牌生產廠家購買血清產品。
四、牛血清在體外診斷試劑中的應用
天然牛血清中含有25-70g/L的蛋白及各類小分子多肽等，在體外診斷試劑（主要是在酶聯免疫、化學發光等方向）中有廣泛的應用，其作用與BSA（牛血清白蛋白）類似，起到保護作用[15]。
目前大致包括以下幾個用途：
1、封閉液
在孔板中包被抗原抗體後，需用牛血清進行封閉。在此項應用時應注意，加入牛血清的孔板部應出現非特異性的OD值，否則，易造成假陽性。
2、稀釋液
牛血清作為稀釋液主要起到保護作用，其中包括酶和質控品的稀釋。要求加入牛血清後的酶和質控品在規定的儲存條件和有效期內，其活力和效價不應有明顯的下降。因此，在更換新批次的牛血清時，應對牛血清進行靈敏度、穩定性等考察。
目前並無資料或文獻表明，胎牛血清在診斷試劑領域的功能性上更勝於新生牛、小牛血清甚至於成牛血清，不過有學者指出出現溶血的血清對ELISA檢測結果會有影響。以IDEXX試劑盒為例，經過多次試驗一塊板同時檢測的結果顯示，溶血對於同一批次血清有一定的影響。對於陰性或者強陽性樣品的檢測結果影響不大，但對於疑似可疑樣品影響較大，直接影響陰陽性的判定。因此推論，用於診斷試劑的牛血清應對血清蛋白進行控制。
由於牛血清的天然不確定性，如若要一個批次的血清能滿足所有診斷試劑的應用是非常困難的。因此，有些牛血清廠家借鑑細胞培養的篩選方式，對不同型別的診斷試劑也進行預篩選，儘可能精準的為診斷試劑使用者提供合適的血清，如專門用於封閉血清或專門用於酶稀釋的血清等。