3D列印的整形外科裝置和手術工具，列印的頜面部植入物和其他列印的脫細胞裝置已經在患者身上使用。相比之下，生物列印的活細胞結構面臨著相當大的轉化挑戰。
在這個視角下，研究團隊首先總結3D生物列印在臨床應用方面的最新進展，重點放在3D列印的軟骨、骨骼和面板如何為個體患者設計並使用患者自己的細胞製造。
然後討論關鍵的轉化考慮的因素，例如確保活裝置與患者血管網路緊密結合的需要，生物相容性生物墨水的開發，以及在獲得生理上相關數量的細胞方面的挑戰。最後，我們概述了未經測試的監管路徑，以及在材料採購、製造、標準化和運輸方面的後勤挑戰。
美國食品和藥物管理局(FDA)已經批准了幾種3D列印裝置用於臨床，包括矯形裝置、患者匹配的植入物、手術指南和修復裝置，如牙橋。然而，到目前為止，3D列印的大多數醫療應用都涉及靜態的非生物結構，旨在用作結構假體或填充空間的假體。
個性化的3D列印鈦板，特別是透過磁共振成像(MRI)和計算機斷層掃描(CT)後的影象重建進行建模，顯著改善了骨腫瘤手術切除後接受組織重建的患者。同樣，3D列印的顴骨成形術模板系統可以比傳統的術中測量提供更高的下巴重新定位的準確性。2013年，一名患有氣管支氣管軟化症的嬰兒植入了3D列印的個性化生物可吸收外氣道夾板。2015年，又有3名嬰兒接受了與患者匹配的3D列印夾板。這些結構雖然是非生物的，但在被身體吸收以適應氣道生長之前，它們被設計成在一段預定的時間內防止外部氣道壓縮。
這些在設計和製造非活體3D列印植入物方面的最新進展說明了3D列印技術在生產先進的患者專用裝置方面的潛力。相比之下，活細胞結構的生物列印面臨著重大障礙，特別是：從合成材料(包括金屬、陶瓷和塑膠)向生物功能材料的過渡，同時保持對微觀和宏觀尺度的機械效能的控制；實現具有生理異質性的組織設計；開發從幹細胞衍生和擴大功能細胞的方法；以及將生物列印的組織與生理血管網路連線起來。
處於臨床前發展階段的3D列印組織仍然缺乏必要的功能元素，如血管、神經、淋巴管，以及大型和複雜的組織和器官所需的功能和支援細胞型別的數量和多樣性。由於這些挑戰，3D列印活組織臨床轉化的早期成功可能涉及相對簡單的組織(而不是具有複雜幾何形狀的臨床相關組織)。
軟骨
軟骨組織是軟骨細胞密度相對較低的無血管和神經性結構。它們的簡單性限制了大規模製造人類軟骨的潛在障礙。然而，由於組織的異質性(帶狀結構)，複製功能性關節軟骨是具有挑戰性的。天然關節軟骨的帶狀結構包括具有不同細胞形態和細胞排列的區域，以及具有不同細胞外基質(ECM)排列、成分和分佈的區域。這種結構上的異質性與組織的拉伸特性有關，這些特性使其能夠抵抗關節施加的剪下力、拉力和壓縮力。
圖1|生物列印的軟骨、骨和面板組織。A，解剖形狀的3D列印軟骨結構(左為人耳，右為綿羊半月板)。B，一種生物列印的人體規模的顱骨結構，可用於面部重建。3D列印顱骨結構的視覺化運動程式(綠色和紅色分別表示聚合物混合物和細胞水凝膠的分配路徑)(左上角)。印刷結構的照片(左)。植入Sprague Dawley大鼠顱骨缺損區(右上)。植入後5個月建造(中右)。植入後5個月的組織學影象(下圖)。C、原位面板生物印花概念。首先掃描傷口(I)以獲得關於傷口形貌的精確資訊(Ii)，然後引導列印頭在適當的位置沉積特定材料(Iii)和/或細胞型別(Iv)。D，面板生物印表機。使用手持ZScanner Z700掃描器進行傷口掃描(左上角)。然後，透過掃描獲得的幾何資訊被輸入到軟體中，用於將掃描的影象定向到標準座標系(右上角)。掃描的資料及其座標系用於生成噴嘴噴頭的填充體積和路徑點(左下角)。列印填充量(右下角)。
軟骨細胞可以從軟骨的不同區域獲得，並透過使用3D印表機沉積在水凝膠(如明膠和海藻酸鹽、軟骨來源的ECM和奈米纖維纖維素和海藻酸鹽)中，這些細胞保持高活性和區域特異性的基因表達。在剪下變薄的奈米纖維纖維素中沉積人類軟骨細胞可以與可交聯的海藻酸鹽結合，以高保真度和穩定性列印解剖形狀的軟骨結構，如人耳和綿羊半月板(圖1A)。噴墨3D列印也被用於修復臨床前模型的軟骨，實現了壓縮模量與透明軟骨相同數量級的組織結構。另一種方法是使用微團軟骨細胞顆粒形成軟骨鏈，用管狀可滲透海藻酸鹽膠囊作為細胞聚集和組織鏈成熟的儲存庫來構建組織結構。這種方法產生了直徑約500μm的單鏈，細胞密度顯著增加，並改善了移植後的成熟度和工程化組織的功能。
3D生物列印的進一步進展將使每個軟骨帶區域的生長因子、機械梯度和幹細胞的模式得以建立，從而改善生物軟化的軟骨組織的功能。
骨骼
雖然骨是最常見的移植固體組織，但傳統的骨組織生物製造技術具有明顯的侷限性和併發症，如缺乏可用的自體材料和供體部位的發病率。因此，大量的努力集中在骨的獨特結構和力學特性的研究上。人們正在嘗試將骨骼的自然再生潛力與生物列印的好處結合起來，例如控制細胞和生物材料的形狀和精確放置在生物列印的支架或生物工程移植物中。
為了重現皮質骨的適當力學特性，許多3D生物列印方法主要依賴於硬支架，因此它們不能完全概括細胞成分的特性。這是一個很大的限制。雖然許多製造技術可以製造出具有合適的相互連線的孔隙率和機械效能的結構，但它們需要應用溫度、溶劑或其他可能對活細胞產生不利影響的條件。細胞的後期播種會導致與細胞分佈不均勻和細胞附著不良相關的問題。透過利用易於細胞生長和組織形成的軟材料，生物列印技術可以滿足硬骨組織的機械需求，同時促進組織再生。一種方法是開發具有堅固的、機械堅固的結構的混合或複合結構，填充沉積在骨傳導水凝膠生物墨水中的精確放置的細胞。
多種生物製造工具和材料的結合似乎有望重現骨骼所必需的力學和生物學特性；但組織形態和功能接近天然骨組織的工程化骨組織仍然難以實現。結果最好的方法仍然是那些成功引導骨癒合以填補損傷的方法。使用生物列印來引導先天癒合過程，以解剖學上準確的形狀填充大的骨損傷(而不是尋求複製骨形成的發育階段的方法)具有臨床潛力。
面板
直接在傷口部位的面板結構的原位生物列印依賴於患者的身體作為生物列印組織功能成熟的“生物反應器”。在傷口癒合方面，這種方法的主要優點是可以快速覆蓋大面積創面的永久性面板組織，並加速癒合。與體外構建的構建物移植相比，原位生物列印避免了在運輸和處理過程中損壞薄而脆弱的構建體的風險，並避免了與複雜三維拓撲結構的正確放置和定位相關的潛在問題。
目前還沒有一種生物列印方法能夠完全複製天然面板的形態、生化和生理特性。加入更多的細胞型別和更具代表性的ECM元件的圖案化是必要的。例如，實現包含表皮、真皮和皮下組織的分層三層結構將是有益的，還可以結合血管、神經、汗腺和皮脂腺、毛囊和色素的成分。此外，未來的面板結構應該促進毛囊的適當發育和調節，色素沉著和表皮的形成和成熟。這需要了解毛囊上部永久區的多能祖細胞的作用，這些細胞有助於毛囊和皮脂腺的形成，以及這些細胞在面板動態平衡和修復過程中與黑素細胞幹細胞的相互作用，這將需要了解毛囊上部永久區的多能祖細胞的作用，這些細胞有助於毛囊和皮脂腺的形成，以及這些細胞在面板動態平衡和修復過程中與黑素細胞幹細胞的相互作用。
當前的挑戰和潛在的解決方案
大多數生物列印的組織和器官規模很小，只包含一到兩種細胞型別，由相對簡單的結構組成，提供的功能有限。生物列印的組織通常缺乏血管網路，因此依賴擴散來提供營養。更復雜和更大的組織的生物列印具有堅固的、可裁剪的機械效能和細胞相容性材料，需要多種型別的功能、祖細胞和支援細胞型別的衍生和擴增方法，以及整合供氧和營養的血管網路的策略。
從現有的生物材料中製造出具有所需功能和生物力學特性的組織結構仍然是一個挑戰。一種方法涉及圖案化合成材料和天然材料(如ECM衍生的水凝膠)的混合構建：合成材料提供物理完整性，並在宏觀水平上控制支架的機械、結構和幾何特性(如彈性模量、拉伸強度、孔隙率和排列)，而天然材料為細胞封裝和放置提供適當的結構和生化環境。因此，在天然組織中使用基於細胞外基質成分的水凝膠用於細胞封裝是可取的，因為它們有助於在列印後提供組織特異性營養物質和細胞產品。
圖2|具有分級屬性的生物材料的3D生物列印。一種混合噴嘴，可用於在微尺度上列印材料，具有不同材料性質的可調梯度。B，具有連續變化的組成梯度的3D矩形晶格橫截面的影象，顯示在強光(左上)和紫外線輻射(右上)下熒光顏料濃度的連續變化。在強光(中)和紫外光(下)照射下，二維晶格結構在8種不同混合比下表現出離散變化的熒光梯度。
然而，一個主要的限制是需要透過生物印刷技術沉積這些材料，這些技術通常依賴於熔融擠壓、具有絕對稀釋性的材料或選擇性交聯方法。另一個限制是，這些材料還必須與細胞成分建立生理、生化和機械相互作用。將機械強度的合成材料與用於細胞包裹和沉積的更軟的水凝膠相結合的方法可能會導致一種結構，在這種結構中，細胞不會暴露在關節軟骨和肌肉等組織成熟所需的適當機械刺激下。此外，許多組織具有生物和生物力學異質性，並與不同型別的組織接觸。
在此背景下，3D生物列印能夠形成材料、細胞和生物因素的濃度梯度，從而能夠再現這些不同的組織屬性。這些問題的解決方案的例子是在兩種不同墨水之間交換的微流控開關噴嘴，以及混合噴嘴，可用於在微尺度上列印具有不同材料性質的可調梯度的材料。
另一個重要因素是要求腳手架的降解時間與主體重建結構的時間相稱。植入的結構應有助於宿主細胞外基質的產生和改建，以允許在既不延遲也不抑制天然組織結構形成的時間尺度內更換任何合成或臨時支撐結構，也不會造成任何過早支架失效的重大風險。因此，需要提供更強機械強度並保持細胞友好環境的ECM改性或ECM模擬材料，以及支援細胞輸送和印刷後生物活性和功能的合成材料。控制材料、細胞和生物因素的空間層次，以及組織製造的動態，提供了許多有待開發的可能性。
體外組織工程構建物，例如在灌流生物反應器中，可以提供氧氣和營養。但在體內植入後，氧氣和營養物質的供應往往受到擴散動力學的限制。因為在工程組織中氧氣的擴散通常比它的消耗慢，所以氧氣是細胞存活的限制因素。因此，當組織的厚度超過營養擴散的極限時，血管化的需要成為一個關鍵因素，功能性3D列印組織的製造將需要結合多尺度的血管、淋巴和/或神經網路。目前，使用3D打印製造的用於移植的大多陣列織缺乏這些元件。
工程組織製造中的一個主要障礙是複製覆蓋動脈和靜脈的天然完整血管網路的複雜層次結構，直至最小的毛細血管。設計了兩種主要的方法來克服目前的限制：在沒有血管的情況下植入微通道以改善營養物質和氧氣的擴散(圖3A)，以及在組織結構內形成血管生長因子或細胞的圖案，以促進體外或移植後的血管發育。然而，雖然這兩種方法都允許製造更大的結構，但它們最終都依賴於內源性血管形成。
圖3|克服擴散限制和血管化的需要。一種用於生成3D架構的圖案化方法，該3D架構包括多個細胞負載的水凝膠、支撐性PCL聚合物和用於改善氧氣和營養物質擴散的微通道孔。B、全方位打印製作血管結構。將逃逸的墨水沉積到物理凝膠儲存庫中(左上角)，可以對分層和分支網路進行圖案化。噴嘴平移產生的空隙被從流體蓋層(右上角)遷移的液體填充。隨後的光聚合反應會產生化學交聯的水凝膠基質(左下角)。墨水在適度真空下液化並取出，露出微血管通道(右下角)。C，一種3D生物列印方法，將血管系統、細胞和細胞外基質共同列印，以產生工程化的、血管化的和不同種類的細胞負載的組織結構(左，示意圖；右，顯微照片)。
以目前的技術，列印微米級的功能性毛細血管在技術上是具有挑戰性的。一種替代方法是首先構建血管網路，然後在活體或生物反應器中成熟，從而讓毛細血管發育。例如，透過借鑑基於犧牲模板材料的技術，人們可以在組織內製造可灌注的微通道網路，例如開發由兩個內皮化的流體通道組成的結構，其中纖維蛋白-內皮-細胞混合物位於它們之間。
這種設計導致形成相鄰的毛細血管網路，並因此產生多尺度血管網路，該多尺度血管網路將毫米級血管與相鄰的微血管系統連線起來。另一種選擇涉及使用圖案化細胞或組織球體對血管網路進行生物列印。例如，將MSCs和成纖維細胞包裹在定製的ECM中的多種生物材料可以與嵌入的血管一起列印，然後與內皮細胞排列在一起(圖3C)。
這種方法能夠創造出厚厚的組織(大於1釐米)，充滿了工程化的ECM、嵌入的血管系統和多種細胞型別。這種生物列印策略的另一個例子包括聚整合多細胞血管組織球體的多種血管細胞型別，並伴隨著瓊脂糖棒作為模板逐層列印。緊密放置的血管組織球體經過組織融合和自組裝成類似於分支血管樹的小片段。另一種策略涉及微型連續光學生物列印，其速度、解析度和靈活性優於傳統生物印表機。在這種方法中，多種型別的血管細胞被直接包裹到水凝膠中，分佈精確，不需要犧牲材料。
值得注意的是，生物印跡的內皮網路和宿主迴圈之間可以發生吻合。儘管在直接製造更大的管道、結合可灌流的微通道網路和刺激血管生成方面取得了進展，但目前的製造方法不能將適合於提供氧氣和營養的完整的多尺度血管網路結合到臨床相關大小的3D列印組織中。從微米到釐米尺度的組織圖案化將需要材料沉積和細胞沉積方面的重大技術創新。微擠壓技術的最新進展使得包含合成材料和天然材料的多組分結構的圖案化成為可能，僅生物材料的解析度可低至2μm，封裝細胞的解析度可低至50μm。進一步的進步將需要能夠在提高列印解析度和列印速度的同時沉積更廣泛的材料型別。一種有希望的方法涉及使用多個噴嘴同時沉積材料的並行化方案：在設計有分層分支通道的多噴嘴陣列的情況下，每個列印頭將生物墨水從單個微通道分配到重複分叉的分支中，以便在列印過程中同時從多個噴嘴沉積生物墨水。
這種方法可以在由單組分和多組分材料組成的高通量、平面和多層結構上進行列印。然而，它還有待於用含有細胞的材料來證明。此外，生物學的進步可能導致血管系統生物列印的改進：例如，內皮細胞之間的關係。
另一種前景看好的通用方法是“模組化組織設計”，其中“組織模組”被縮放以納入相關的血管化策略，這些策略考慮了每種方法的侷限性。例如，小組織模組可以結合一系列可灌流的微通道，並結合刺激血管生成萌芽和生長的方法。然後，這些小的組織模組可以與更大的直接製造的血管網路組裝在一起，並以內皮化微血管的分支網路為圖案，該分支網路連線到能夠吻合的毫米級血管。這將需要開發高通量、高解析度的生物列印方法，在具有指導意義的生物墨水中列印多尺度的血管網路，以促進血管新生萌芽和新生血管的形成。
成功3D列印組織的共同屬性包括：
複製天然組織的3D結構、大小和形式
在微觀和宏觀尺度上包含適當的機械屬性
包括組織功能和維持組織穩態所需的細胞型別
在足以替換、恢復或補充體內組織的水平上覆制組織或器官功能
此外，生物印表機的進一步發展可以加快製造時間表，併為臨床相關規模的功能組織的製造提供所需的解析度。加快製造過程的方法，例如生物印表機或材料技術的進步，在未來可以克服目前逐層列印的緩慢速度。雖然還沒有進行醫療裝置製造的測試，但原則上，連續液體介面生產方法可以以每戶數百毫米的速度列印複雜的固體部件。
綜上所述，臨床上相關的生物列印結構很可能需要達到功能和支援細胞型別(包括幹細胞)的閾值，具有在微觀和宏觀尺度上與天然器官相似的生物力學特性，並且具有跨越動脈、靜脈和毛細血管的完整血管網路。生物列印的軟骨、骨和面板結構部分符合這些標準。
儘管3D列印組織結構的規模和功能繼續改善，但對於生理要求更高的更復雜組織的生物列印來說，仍然存在重大挑戰。在臨床相關生物列印組織和器官的多尺度和多組分製造方面的進展將需要納入在分離和擴大原代細胞和幹細胞群體方面的進展，開發“智慧”生物材料，以及整合互補的生物列印技術。