專案的名稱: ph 調節法提取牡蠣蛋白 摘要：以牡蠣全臟器為原料,採用pH調節法（pH-shifting）分離提取牡蠣分離蛋白並對其氨基酸組成及蛋白組成進行分析。試驗結果表明,牡蠣分離蛋白提取最佳鹼溶條件為pH 12~13,最佳酸沉條件為pH 4.5~5.1。在最佳提取條件下獲得的牡蠣分離蛋白得率為66.7%,蛋白純度達92.5%（幹基計）。牡蠣分離蛋白各種必需氨基酸均高於FAO/WHO推薦值,約佔總氨基酸的42.36%,風味氨基酸和支鏈氨基酸含量也較高。c (蛋白質濃度)=112.64、提取率=75.8%、蛋白質粗含量=81.7%、蛋白質獲得率=66.7%、水分含量=11.7%。SDS-PAGE電泳圖譜顯示牡蠣分離蛋白在200,97,44 ku處均出現比較明顯的蛋白條帶。本研究結果將為進一步開發利用牡蠣蛋白資源提供理論依據。 關鍵字：牡蠣；PH調節法；凱氏定氮法；SDS-PAEG電脈測定目的與要求:1.掌握動物蛋白質提取方法;2.掌握鹽析原理;3.掌握離心技術;4.掌握透析原理及過程;4.掌握SDS-PAEG電脈測定儀測定蛋白質組成成分

1.實驗原則 ph 調節法進行提取的動物蛋白質就是透過使用蛋白質處於等電點的時候溶解程度最小的原理。當等電點時蛋白質的淨電荷係數變為零,失去了蛋白質的水化膜和其他分子間相斥反應作用,疏水性氨基酸殘基被充分暴露,蛋白質與其他分子相互依附,聚集,易從細胞中形成沉澱和析出。雖然在一般的情況下,蛋白質比其他來源蛋白更容易在鹼性環境中或者較強的酸性環境中被溶解,但是不同的來源蛋白最佳鹼融與酸沉 ph 值仍有著較大的差異。

2.材料與實驗方法

2.1材料與實驗試劑

牡蠣、牛血清白血球蛋白;folin一酚生物蛋白質含量穩定性濃度測量檢驗試劑盒;bradford一酚蛋白質濃度穩定性測量檢測試劑測試盒及藥品盒;乙醯硫酸氯化銅;乙醯硫酸氯化鉀;硫酸;2%的乙醯硼酸標準溶液;鈉的混合鹽酸指示液;40%的硫酸氫氧化鈉標準溶液;0.01mol/l二甲基乙醯硫酸標準溶液或0.05mol/l二甲基乙醯鹽酸標準溶液;0.1mol/lnaoh/l調節標準溶液;0.1mol/lhclol調節標準溶液等

2.2實驗裝置

kdn一102c凱氏定量液氮儀;phs一3cph光度計;uv-2100紫外線高分子鐳射儀的光度係數測量計;bs300一個高標準精度的電子天平;5804r臺式高速式的大容量磁力離心機;85-2恆溫式的磁力離子攪拌器;sds-page一0電脈衝溫度測定儀;sc凱氏定氮控制裝置;冷凍乾燥控制裝置;1000w的恆溫電爐。SDS-PAGE電脈測定儀;凱氏定氮裝置;冷凍乾燥裝置;1000w電爐。

2.3方法及步驟

2.3.1牡蠣分離蛋白最佳鹼性溶劑使用條件的確定

分別稱取牡蠣勻漿15g ,按1:3(濃度質量與體積之比)依次新增人蒸餾水,採用0.1 mol / l naoh 調節溶液 ph 值分別設定為9,10,11,12,13,然後再次在冷凍冰浴中依次採用高速分散機進行勻漿5min (勻30s 停30s ),4℃溫度條件下放置下磁力攪拌器上攪拌3h 後,10000r / min ,4℃溫度條件下離心15min ,收集上清液,100ml 大小的容量開瓶進行定容,然後使用 folin -酚蛋白定量試劑盒檢測鹼性提取液的吸光度,對照標準曲線( y =0.0014x +0.0101)透過計算得出蛋白質的含量,確定了最佳鹼性溶 ph 值。

2.3.2牡蠣蛋白分離磷酸鹽蛋白的最佳酸沉條件的確定

在2.3.1節的溫度條件下首先製備牡蠣蛋白鹼溶解提取液,分別吸入30mL於8個燒杯 中,採用0.1 mol / l hcl 兩個溫度調節溶液的 ph 值分別設定為3.6,3.9,4.2,4.5,4.8,5.1,5.4,5.7,然後4℃溫度條件下放置1h 後,10000r / min ,4℃離心15min ,分別從上清液中收集沉澱和上清液,上清水採用100ml 大小的容量瓶進行定容,然後使用 folin -酚蛋白定量試劑盒檢測鹼提取液的吸光度,對照標準曲線( y =0.0014x +0.0101)進行計算得出蛋白質的含量,確定最佳酸沉 ph 值。2.3.3實驗步驟

新鮮牡蠣→剝殼打碎成漿→再次稱量→按1:3(打漿質量和體積的比例分配均勻後可再加入少量蒸餾水)→0.1mol/lnaoh快速調節至達到最佳的耐鹼性和溶解水ph的數值→高速溶液分散機勻漿5min(冰浴)→4℃下連續透析攪拌3h→10000r/min,4℃離心15min→再次連續提取出以上清液→0.1mol/lhcloh調節至最優的最佳酸溶和沉澱溶ph的數值→10000r/min,4℃離心15min→再次取出酸沉澱→4℃以上溫度下連續透析加水過夜→冷凍乾燥→放入密閉塑膠包裝冷凍儲存。

（1）凱氏定量液氮分析法測定消化牡蠣中總量的蛋白質元素含量(粗蛋白)①樣品消化

稱取0.3g重的牡蠣澱粉作為消化均漿,移入乾燥的100ml凱氏燃燒儲氣瓶中,加入0.2g的濃硫酸氧化銅和6g的濃硫酸鉀,稍微攪拌搖勻後,用小小的漏斗由內向外擠壓加入20ml濃硫酸,將燃燒瓶以45°度的角斜向分支於一張帶有小排氣孔的白色石棉網上,使用萬用表或電爐時將其置於室內空氣通風櫃中並每加熱一次進行樣品消化。開始時首先採用連續低溫加熱方式對其進行低溫加熱,待所有泡沫液體內容物完全溶解碳化,泡沫液體燃燒過程停止後,再將逐漸升高的泡沫溫度繼續維持微沸,消化至所有溶劑和泡沫液體混合形成蘭顯的綠色或者清澈澄清後,再在預熱鍋爐中進行繼續低溫加熱0.5h。在開始加熱水的過程中應在結束小心翼地新增20ml的蒸餾水,冷卻後,無損地將其全部轉移至100ml相同大小的固定容量的大玻璃瓶中,加水之後進行保溫定容。混勻後即為消毒滅菌劑(此液即無毒消化液)。空白對照實驗:不新增試劑取樣,其他方法操作與取樣相同,得到試劑的空白消化液。

②定氮裝置的檢測和洗滌。

檢查定氮微量裝置，在蒸汽事件發生時的瓶內放置2/3體積大小的水,加一滴甲基紅色的指示劑數滴和數毫升的硫酸,以保證水溶液呈現弱酸性,加入幾粒玻璃珠(或者稱為沸石)來防止水暴沸。測定前先將定義的含氮清除裝置按以下幾種洗滌方法進行清除一共洗滌2-3次:從測定樣品的內部進入進出口中新增少量的氨水(大約可能佔整個固體反應器鋼管的1/3),將其內部通入加熱空氣用其中的加熱蒸汽對氮進行加熱煮沸,產生的氮在空氣中再用水進行沖洗後形成新的冷凝管;數分鐘後立即自動關閉新的夾子b和a,使得整個反應器鋼管內部內的廢液被空氣倒吸,流到整個反應管溫室的鋼管外層,開啟後將新的夾子a和b由整個橡皮管內部排除。每個機器人反覆幾次,即可全部投入使用。

取出硼酸鹽水溶液混合試劑20ml於一個白色圓錐形玻璃瓶中,加入硼酸混合後的溶液指示物2-3滴,並注意使冷凝管直接插入少量硼酸鹽水溶液試劑表層下。在沒有螺旋驅動夾子a和a自動停止關閉、在沒有螺旋驅動夾子a和b自動停止開啟的特殊環境工作條件下,準確地自動吸取10.0ml少量樣品的內部消化液,由小型的漏斗自動將其溶液加入化學反應實驗室,並以10ml的少量蒸餾水進行沖洗後後再進行樣品封口內部溶液流入化學反應實驗室,塞緊一個形成棍狀的琉璃玻塞。將10ml不含氫氧化鈉的氨水溶液均勻地地倒入小玻璃漏斗,提起後將玻璃放入塞內並使之緩緩地使水流入離子反應器泵房,用少量的蒸發水進行沖洗後立即將粘在玻璃上的塞完全覆蓋緊,並在小玻璃漏斗內壁上再次加水後再進行一次水封。開啟自動螺旋塑膠夾a、關閉自動螺旋夾b,開始快速蒸餾。通入的加熱蒸汽經過1分鐘的連續蒸餾10分鐘後,移動到水的接受瓶,液麵上部分並離開冷凝管的下端,再次進行蒸餾2分鐘。然後用少量的冷開水下來沖洗一個冷凝管的下下端外側,取出一個錐形瓶,準備將其進行滴定。同時將10.0ml的滴定試劑液由空白液和消化液依次過濾吸取,按照前下後上法分別進行二次蒸餾和過濾操作,得到一份均勻滴定的試劑空白液。

④樣品滴定

將實驗樣品以0.01mol/l的三氯鹽酸標準溶液進行滴定一直到樣品灰色或者藍色和紫色之間的最末端終點。採用一個folin一酚各種蛋白質濃度穩定性測的試劑盒可以進行用來測定各種牡蠣酸磷-[UNK]的鹼性酸提取液中各種蛋白質的穩定含量;同時使用fobradford各種蛋白質濃度定量測序的試驗方法使該試劑盒可用來進行測定酸沉式上清液產物中的各種蛋白質穩定含量。

2.離心 將打漿後的牡蠣水進行稱量,按1:3(體積與質量之比)加入蒸餾水中新增0.1mol / l naoh 調節到最佳鹼溶 ph 值,用高速蒸餾分散器勻漿5min (冰水洗澡),在4℃下連續攪拌3h ,再用10000r / min 的低壓離心機在4℃的溫度下連續離心15min ,取出上清液,用0.1 mol / lhcl 調節到至最優酸沉 ph 值,應用10000r / min 離心機,在4℃的溫度下離心15min 。

3.鹽析(酸沉澱) 採用0.1mol/LHCl溶液對離心後取的上清液進行鹽析。加入0.1mol/LHCL溶液調節至最佳酸沉澱PH值。最佳酸沉澱PH值範圍在4.5~5.1。

4.透析 取一段放置於透析袋,將其一端用透析袋夾緊緊包裹牢固(或者再次擊打一個死結),由其在開口的另一端加入一種含清蛋白沉澱的溶液(但是不可使包裹物裝得太滿,留出一半的空隙,並適當地排出一半的空氣,以防止使透析袋膨脹而破裂),用透析袋夾緊緊包裹好袋口(或者再擊打一個死結)。取一個大型電子燒杯,加入10倍以上的透析樣品液或大體積的脫氧去氯等離子水或其他緩衝溶液,將已經包裝好透析樣品的兩個透析袋均勻懸於大型電子燒杯中部,底部再向上放一個大型磁子,用大型磁力泵或攪拌器緩慢地進行攪拌以有效率地促進均衡溶液的磁性交換,透析液的過程中每天都根據需要反覆更換溶液洗脫均衡溶液數次(約30min一次),至溶液達到一個透析均衡溶液狀態濃度為止(在新的洗出液中無Cl-和NH4+)。

5.SDS-PAGE測定牡蠣分離蛋白組成 本文主要採用sds-page電泳測定方法對其進行牡蠣蛋白質主要成分的分析測定;提取濃縮蛋白膠5%,分離蛋白膠12%,採用r-250考馬斯亮藍法對其成分進行了生物染色和化學穩定效能的檢測。

6.水分含量測定（直接乾燥法）

蠣分離蛋白氨基酸組成測定

稱取50g的蛋白樣品,加入2ml5.7mol/lhcl,置於110℃的預熱烤箱內,水解24h,然後將hcl水分除去,再以中性緩衝溶液快速加熱至並稀釋至一定的溶液體積,搖勻。色氨酸的化學測定方法主要是透過使用5mol/naoh對其分子進行弱酸或鹼性時的水解。採用臺式氨基酸自動溶液分析儀技術進行溶液分析,上機需要工作裝置條件:溶液流動相容量分別為專門的鹽酸緩衝劑溶液pl-1,2,3,4(分別指的是使用ph2.2,3.3,4.0,6.4檸檬酸鈉的緩衝液);工作流速:0.225ml/min;工作溫度:25℃;上樣工作時間一般應在50ul。

3.計算公式

牡蠣蛋白質質量提取率的主要計算公式一般表示為如下:主要蛋白質質量提取率(%)=(不含鹼二氫提取液主要蛋白質生物質量(mg)/含量牡蠣總主要蛋白質生物質量(mg))×100

蛋白質質量獲得的比率(%)=(不含鹼二氫提取物酸液或沉澱液蛋白質生物質量(mg)/含量牡蠣總主要蛋白質生物質量(mg))×100

蛋白質質量獲得的比率(%)=牡蠣主要蛋白粉中的質量/含量牡蠣主要原料中的幹基蛋白質量×100

粗蛋白質總含量(x)=(v1-v2)×c×0.0140×f×100/(m×10/100)

4.結果與分析

4.1分析

由圖1可知,在pH9~13範圍內,隨著pH值逐步提高,牡蠣蛋白提取量不斷增加,資料分析顯示,pH12和pH13條件下牡蠣蛋白提取量達到最大,並且兩種條件下所提取牡蠣蛋白量無顯著性差異,可以確定牡蠣蛋白最佳鹼溶pH值為12~13。由圖2可知,在酸調節pH3.6~5.7範圍內,隨著pH值的逐步提高,上清液中牡蠣蛋白殘留量呈先下降後上升趨勢,資料分析顯示,pH4.5,48和pH5.1條件下上清液中牡蠣蛋白殘留量最少,並且3種條件下所提取牡蠣蛋白量無顯著性差異,確定牡蠣蛋白最佳酸沉pH值為4.5~5.1。

4.2實驗資料

c (蛋白質濃度)=112.64、提取率=75.8%、蛋白質粗含量=81.7%、蛋白質獲得率=66.7%、水分含量=11.7%。

由圖中表2我們可以知道牡蠣分離蛋白質所必需的氨基酸構成豐富約為總氨基酸的42.44%且其中明亮氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的含量都比較高各種必需氨基酸的含量都要高於 fao / who 的推薦值。氨基酸作為食品中最重要的一種呈味類化學物質海藻貝肉因其特殊鮮味而受到青睞這與共同包含的較高呈味氨基酸密切聯絡在牡蠣分離蛋白氨基酸的組成中它所產生的風味氨基酸含量可以達到42.28%的支鏈氨基酸它們具有獨特的生理作用,它們能夠消除或降低患者肝性腦疾病的症狀,改善患者的肝臟功能及患者蛋白質營養喪失狀態和抵抗疲勞等作用牡蠣分離蛋白的支鏈氨基酸含量在20.31%之下均超過貽貝分離蛋白和羅非魚肉分離蛋白的支鏈氨基酸。透過比較發現牡蠣分離蛋白可作為一種良好的食品蛋白質來源。

國內外已有很多研究人員運用聚丙稀醯胺凝膠電泳 s - page 技術對水產蛋白的構造進行了研究。本課題研究透過採用聚丙稀醯胺凝膠電泳 sds - page 等先進的技術方法來測定牡蠣分離蛋白中蛋白質的組成,並且同時對經過 b -基乙醇還原後再處理的蛋白樣品與未經 b -基乙醇還原後再處理的蛋白樣品之間的差別進行了比較,結果可參考圖3.從圖3可以清楚地看出,牡蠣分離的蛋白質經過 b -基乙醇還原處理後得到樣品的電泳光譜圖和其他未經處理的樣品之間存在著很大的差異-基乙醇能夠透過開啟蛋白質的第二個硫鍵,使蛋白質中的亞基從電泳膜中游離了出來,經過 b -基乙醇還原處理後得到的樣品電泳光譜線條帶要多於其他未經處理的樣品電泳光譜線條帶,這與我們進行的研究成果相一致。經過採用b-基乙醇聚合法純化處理的兩個樣品在200,97,44ku兩個白色區域都分別在較為明顯的兩個蛋白質合成條帶上均顯示有囊泡出現。肌原纖維肌動蛋白由膠原肌球蛋白組成重鏈(mhc)輕鏈、肌動蛋白和重鏈a-輔肌動蛋白等三個部分輕鏈組成,在結構圖中200ku附近處一點為膠原肌球蛋白的一個重鏈,而在44ku附近一點處則為肌動蛋白。而且與魚類蛋白不同的地方就是,貝肌肉蛋白還包括了一個可以形成細胞粗絲的核心蛋白副肌球蛋白,牡蠣分離蛋白在97ku 附近會出現明顯的蛋白條帶,稱之為副肌肉蛋白。

4.3結果

在最優提取的條件下,採用 ph 調節方法進行製備所獲得到的牡蠣分離蛋白,得率大約為66.7%,蛋白質的純度可以高達92.5%(幹基),必需氨基酸的含量豐富,高達42.36%,各種必需氨基酸的含量均遠遠高於 fao / who 的推薦值,風味氨基酸和支鏈氨基酸的含量也比較高。蛋白質組成分析結果表明牡蠣分離蛋白包括肌球蛋白、肌動蛋白和副肌球蛋白。本文研究的結果可以為貝類分離蛋白原料作為高品質的營養蛋白原料在實際使用保健食品製造工業中的應用提供了理論依據和實踐資料,併為進一步地加工和利用貝類資源來開發貝類高附加值的新型產品,提供了有效路線。

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