這項研究的目標是使用3D生物列印技術建立包含人牙髓幹細胞(HDPSCs)的生物工程牙科結構。為了實現這一目標，研究團隊首先開發了一種新型的骨形態發生蛋白(BMP)肽-栓系生物墨水配方，並檢測了其流變特性、可印刷性和生物列印構建體的結構穩定性。

其次，透過測量細胞活力、增殖和基因表達，以及組織學和免疫熒光分析，評估了hDPSCs在生物列印牙科結構中的存活和分化。結果表明，多肽成功地偶聯到基於甲基丙烯酸明膠(GelMA)的生物墨水配方中。

團隊發現，在體外細胞培養3周後，50%以上的多肽仍留在生物印跡載體中。人DPSC在列印過程後立即生物列印的構建體中的活性>90%。茜素紅染色顯示骨形態發生蛋白多肽構建組的鈣化程度高於生長培養基、成骨培養基和非骨形態發生蛋白多肽構建組。

此外，免疫熒光和定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析表明，牙本質涎磷蛋白(DSPP)和骨鈣素(OCN)在BMP多肽牙科結構中有較強的表達。綜上所述，這些結果有力地表明BMP肽鏈生物墨水可以加速hDPSCs在三維生物列印牙科結構中的分化。

關鍵詞：三維生物列印；生物墨水；牙髓幹細胞；牙齒再生；組織工程

顱面損傷和相關的牙齒脫落是影響美國和全世界數百萬人的重大健康問題。人工牙種植是目前黃金標準的牙齒替代療法，然而，它們缺乏天然牙齒的許多關鍵特性，並且可能與導致種植失敗的併發症有關。

因此，生物工程牙蕾已經被提出作為一種更好的替代牙齒替代方案。為了促進創造生物工程牙齒的努力，在組織工程和再生醫學領域取得了長足的進步，創造了3D生物列印技術，能夠使用各種細胞型別、生物材料和生物活性分子來生產組織結構。

這些技術能夠將活細胞沉積成所需的形狀或圖案，以逐層方式產生複雜的組織結構。由於人體的解剖幾何結構高度複雜，不容易被其他製造方法複製，3D生物列印策略在將組織工程應用轉化為臨床應用方面具有巨大的潛力。

在許多3D列印方法中，基於微擠壓的方法是基於細胞的生物列印方法中最常見的方法。水凝膠是用於細胞生物印刷的生物墨水的主要成分，因為它們可以被修飾和配製，以提供最佳的印刷性、結構完整性和生物特性。幾種由天然衍生材料製成的水凝膠，如明膠、膠原、海藻酸鹽和纖維蛋白，已被廣泛用於生物列印應用。甲基丙烯酸明膠(GelMA)是一種由明膠改性而成的水凝膠，易於合成，可透過紫外光交聯固化。

在臨床應用中，需要重複區域性給藥以達到達到治療效果所需的生物活性。為了避免這個問題，我們在這裡使用了一種人工合成的BMP-2模擬肽，它由天然BMP-2中存在的氨基酸序列(KIPKASSVPTELSAISTLYL)組成，它在成骨分化過程中非常活躍。這種BMP-2模擬肽的優點包括與天然BMP-2相比成本更低，並且容易合成所需的氨基酸序列，可以根據需要進一步定製。

Ji Hoon Park團隊的目標是透過生物列印人牙髓幹細胞(HDPSCs)和連線生物墨水的BMP模擬肽來建立一種生物工程牙科結構。假設BMP模擬肽繫留生物墨水可以加速hDPSCs在生物列印的牙科結構中的分化。在這項研究中，團隊使用了一種硫代化的BMP模擬肽，它直接結合到基於GelMA的生物墨水配方中，檢測了生物列印牙科結構的流變性、可印刷性和結構穩定性。為了評價生物印跡牙體的生物學特性和hDPSC的分化，測量了細胞的活性和增殖，礦化組織基質的產生，並用免疫熒光和定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qrt-pcr)分析牙髓幹細胞分化標誌物的表達。

將人DPSCs培養在含有440mLDMEM/F12培養基和50mLFBS(HyClone，Logan，UT，美國)、25µg/mL抗壞血酸(微孔Sigma)、5mLGlutaMAXTM補充劑(Life Technologies)和抗生素/抗真菌(A/A)(Life Technologies)的正常生長培養基(NGM)中。媒體每3天更換一次。細胞在達到約80%融合後傳代。在所有實驗中，人的DPSCs擴增到最大傳代數為7代。或者，在含有神經生長因子和成骨補充劑(50µg/mL抗壞血酸、100nM地塞米松和10 mMβ-甘油醛-3-磷酸)的成骨培養基(OM)中培養hDPSC，以確認其分化(補充圖1)。在紫外光交聯過程中，硫代化的BMP模擬肽被直接偶聯到GelMA水凝膠中(圖1A，B)。

圖1.明膠甲基化過程和BMP模擬肽與GelMA的偶聯。(一)明膠是用甲基丙烯酸酐(MAA)甲基丙烯酸化生成明膠的。然後將GelMA交聯，在光引發劑和紫外光照射下，合成的含有巰基(-SH)的BMP肽與GelMA結合。(B)本研究中使用的生物列印工藝的概念設計。將含有GelMA、hDPSCs和BMP-SH的生物墨水擠壓生物列印，然後進行UV交聯。在體外細胞培養過程中，hDPSCs分化為牙源性細胞。(C)用不同量的MAA/明膠(mL/g)合成GelMA的1HNMR分析。(D)GelMA的甲基化百分數(%)取決於MAA的用量(n=3)。(E)FITC-BMP結合的GelMA構建物的歸一化熒光強度(n=3)。

在1 Hz振盪頻率和0.1%振盪應變下，分析了GelMA和BMP-GelMA水凝膠在UV交聯前後的流變特性(圖2A，B)。GelMA和BMP-GelMA生物墨水在紫外光交聯前表現出~2kPa的儲能模量(G‘)，在紫外光交聯後急劇增加到~4kPa。

圖2.GelMA和BMP-GelMA結構的力學效能。(A)透過應變掃描測量的儲能模量(G‘)和損耗模量(G“)。在有和沒有BMP偶聯以及交聯前後對GelMA進行了測試。(B)交聯前後(每組n=15)BMP偶聯前後GelMA的儲能模量(n=15)。(C)透過壓縮試驗(n=3)測量有無BMP偶聯的交聯GelMA的楊氏模量。(D)有無結合BMP的GelMA生物墨水的溶脹率(n=3)。(E)在有和沒有BMP偶聯的情況下，GelMA生物墨水隨時間損失的百分比(每組n=3)。所有資料均以平均SD表示。給出了雙側學生t檢驗的p值。N.S.表示沒有意義。

在研究團隊以前工作的基礎上，我們優化了GelMA基生物墨水的列印引數，並能夠打印出含有點陣和固體立方體結構的hDPSCs的GelMA基構建物(圖3A)。

圖3.生物印跡構建物中人DPSC的活性和增殖。(A)列印程式碼示意圖、生物列印設定照片以及列印的格子和實心立方體結構。(B)在列印後1、4、7和14天，對生物列印構建體中的hDPSCs進行活/死染色(n=3)。(C)細胞存活率百分比的量化。(D)生物印跡構建物內hDPSC的細胞增殖(n=3)。

為探討BMP模擬肽對hDPSC分化的影響，分別在NGM、OM和OM-D中培養並分析了生物印跡的hDPSCs-GelMA和BMP-GelMA構建物在2周或4周時的分化情況。HE染色檢測細胞形態和細胞外基質生成(圖4A)。H&E染色結果顯示，培養2周和4周細胞分佈均勻，表明細胞在培養過程中在生物墨汁中保持均勻分佈。

圖4.三維牙科結構中hDPSCs的成骨分化。(A)H&E和(B)茜素紅染色：在體外培養和生物墨水條件下，分別於2周和4周對3D生物列印牙體進行染色。(C)茜素紅染色定量(n=3)。給出了雙因素方差分析和土耳其檢驗的p值。NGM：正常生長培養基，OM：成骨培養基，OM-D：不含地塞米松的OM。

切片的GelMA和BMP-GelMA結構的免疫熒光染色被用來研究DSPP和OCN在3D生物列印的牙齒結構中的表達(圖5A)。

圖5.體外培養的3D生物列印牙科結構的成骨分化標誌物的表達。免疫熒光染色顯示(A)DSPP和(B)OCN在不同介質和生物墨水條件下2周和4周後在生物列印構建體中的表達。定量(C)DSPP和(D)OCN表達(n=3)。給出了雙因素方差分析和土耳其檢驗的p值。NGM：正常生長培養基，OM：成骨培養基，OM-D：不含地塞米松的OM

定量RT-PCR分析是對3D生物列印的牙齒結構進行的(圖6)。評估了牙源性標記物dspp和成骨標記物的表達。

圖6.體外培養的3D列印牙科結構的qRT-PCR分析。(A)RUNX2，(B)COL1A1，(C)BGLAP和(D)DSPP在不同介質條件下2周和4周生物印跡構建物中DPSCs的基因表達.

在這項研究中，研究團隊使用了硫代化的BMP肽，在紫外光交聯過程中，它可以簡單地與GelMA水凝膠中的雙鍵偶聯，從而在3D生物列印構建體中提供BMP肽的長期穩定性和有效性。FITC標記的BMP-SH的穩定性實驗表明，BMP-SH與GelMA的結合穩定，孵育3周後，BMP-SH在生物印染的牙體中的存留率超過40%。此外，在UV交聯前後，BMP偶聯對生物墨水的降解輪廓、溶脹率或力學效能沒有顯著影響。無論有無BMP偶聯，細胞存活率和細胞增殖率都很高。因此，透過與GelMA的簡單混合，發現BMP-SH可以被加入到GelMA生物墨水中，而不會影響生物墨水的基本效能。這是一個重大的好處，因為它使生物墨水中加入BMPSH成為一個簡單而直接的過程。

在這裡，研究團隊描述了一種新型的BMP模擬肽-繫留生物墨水的開發，用於3D生物列印的生物工程牙齒組織構建。這種生物墨水配方提供了適當的印刷適宜性和牙齒特有的微環境，以支援hDPSC的分化。本研究結果表明，BMP-GelMA生物墨水配方支援hDPSC的高活性和高增殖，並加速其在三維生物列印構建物中的牙源性分化。總之，這些結果表明，3D生物列印策略與一種新型的BMP肽繫留生物墨水相結合，具有創造生物工程牙齒組織結構的巨大潛力，用於未來再生醫學和牙科領域的應用。