細胞增殖檢測總結

細胞增殖是生物體的重要生命特徵，是生物體生長、發育、繁殖以及遺傳的基礎。細胞增殖檢測是基礎醫學研究中常用到的一種檢測手段。細胞增殖的研究方法有很多，以下內容為細胞增殖檢測方法的總結。

一、分子水平

研究細胞增殖的一種方法是觀察增殖細胞中表達但非增殖細胞中不存在的特定蛋白質。細增殖相關的蛋白包括： Ki67，PCNA ，MCM。

Ki-67

PCNA

PCNA（增殖細胞核抗原）是一種分子量為36KD的蛋白質，在細胞核內合成，並存在於細胞核內，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反應細胞增殖狀態的良好指標[3]，但多項研究表明，評估不同來源腫瘤中的細胞增殖時，Ki-67 的敏感性和特異性更高。

MCM

MCM 標誌物日益受到關注，最新研究表明，相較 Ki-67 和 PCNA，MCM 可能是瞭解癌症預後的更好選擇[4-5]。

二、細胞水平

檢測增殖狀態常用的細胞水平檢測包括：MTT，XTT，WST-1，CCK-8，Brdu染色法，Edu染色法，RTCA（real time cell analyzer，實時細胞分析法）和克隆形成實驗等。

MTT，XTT，WST-1 和CCK-8都用於間接定量增殖（呼吸）細胞的生化測定。

CCK-8試劑中含有WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯） -2H-四唑單鈉鹽）它在電子載體 1- 甲氧基 -5- 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS ）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臢產物(Formazan)。生成的甲臢物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在 450nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。

EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物。它也能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在複製的DNA分子透過基於EdU與Apollo熒光染料的特異性反應檢測DNA複製活性，透過檢測EdU標記便能準確地反映細胞的增殖情況。

EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內很容易 擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細胞和組織水平能更準確地反映細胞增殖等現象。而BrdU需要變性DNA後才能與抗體結合，破壞了DNA雙鏈結構，影響了Hochest等染色，導致染色彌散，準確性降低等問題，逐漸被EdU取代。

RTCA（real time cell analyzer）實時無標記細胞分析技術

該技術術採用特殊工藝，將微電子細胞感測器晶片整合到表面適於細胞貼附與生長的細胞檢測板的底部或細胞浸潤遷移板的微孔膜，用以構建實時、動態、定量跟蹤細胞形態和增殖分化等改變的細胞阻抗檢測感測系統。當貼壁生長在微電極表面的細胞引起貼壁電極介面阻抗的改變時，這種改變與細胞的實時功能狀態改變成相關性，透過實時動態的電極阻抗檢測可以獲得細胞生理功能相關的生物資訊，包括細胞生長、伸展、形態變化、浸潤及遷移、死亡和貼壁等。

細胞克隆形成實驗

當單個細胞在體外增殖6代以上，其後代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。集落形成率表示細胞的獨立生存能力。各種理化因素可能導致細胞的克隆形成能力發生改變。透過一定的實驗方法可以對細胞的克隆形成能力進行檢測，細胞克隆形成率即細胞接種存活率，克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

三、組織水平

1、檢測分子標誌物。

1）石蠟切片，用免疫組織化學方法（IHC）檢測增殖相關的分子標誌物（PCNA，Ki67和MCM）。

2）新鮮組織樣本，Western blot或者qPCR檢測蛋白, mRNA/lncRNA。

2、石蠟切片染色檢測細胞形態和組織結構上的差異

四、動物水平

1、移植癌動物模型，記錄移植瘤體的大小/體積，重量等引數。

2、分子檢測，Western blot或者qPCR檢測蛋白和RNA。

3、組織，免疫組織化學方法（IHC）檢測增殖相關的分子標誌物（PCNA，Ki67和MCM）。

五、臨床樣品

1、組織石蠟切片

2、血清

1參考文獻

1. Oka, S., Uramoto, H., Shimokawa, H., Iwanami, T. & Tanaka, F. The expression of Ki-67, but not proliferating cell nuclear antigen, predicts poor disease free survival in patients with adenocarcinoma of the lung.Anticancer Res. 31, 4277-4282 (2011).

2. Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q. & Zheng, J. N. Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review).Mol. Med. Rep. 11, 1566-1572 (2015).

3. Bologna-Molina, R., Mosqueda-Taylor, A., Molina-Frechero, N., Mori-Estevez, A. D. & Sánchez-Acuña, G. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors.Med. Oral Patol.Oral Cir.Bucal 18, (2013).

4. Carreón-Burciaga, R. G., González-González, R., Molina-Frechero, N. & Bologna-Molina, R. Immunoexpression of Ki-67, MCM2, and MCM3 in Ameloblastoma and Ameloblastic Carcinoma and Their Correlations with Clinical and Histopathological Patterns.Dis.Markers 2015, 8 pages (2015).

5. Szelachowska, J. et al. Mcm-2 protein expression predicts prognosis better than Ki-67 antigen in oral cavity squamocellular carcinoma.Anticancer Res. 26, 2473-2478 (2006).