撰文 | 小黑

責編 | 兮

血清素，又稱5-羥色胺，是一種單胺型神經遞質，能夠影響人的認知行為。血清素分泌失調可以造成精神疾病，比如抑鬱，焦慮等等【1】。針對這些病症的藥物研發需要深刻理解血清素通路，也就是說，我們需要一個高解析度感測器能在時間和空間上精確測量血清素的釋放，流動過程。傳統的血清素測量方法有微透析, 快掃描迴圈伏安法和放射性同位素示蹤技術，但是它們或多或少在空間或者時間上無法取得較高的解析度。最近10年隨著熒光蛋白標記技術的發展，科學家可以直接對神經遞質和神經調節劑進行精確成像，從而能夠研究它們對動物行為的影響【2】。

熒光蛋白標記技術需要將目標蛋白與帶有熒光蛋白修飾的G蛋白偶聯受體或者微生物周質結合蛋白 (periplasmic binding proteins，簡稱PBPs) 進行結合，從而能在顯微鏡下進行成像。然而基於G蛋白偶聯受體的感測器過於敏感，並且很難在細胞內部進行標記，因此不適用研究血清素的輸運過程。所以這裡主要採用的是基於PBPs的感測器【3】。PBPs具有可溶性，可作用於細胞內部，但是其具有一些缺陷，比如跟藥物作用的蛋白的靶點不多，由於來源於微生物，不太參與細胞中的訊號通路，此外PBPs與小分子結合時會使構象劇烈變化，從而導致熒光訊號動態範圍過寬。

通常大家透過設計結合位點去改進PBPs感測器解決上述困難。比較常用的是點飽和突變技術對PBPs的基因進行改造，獲取突變的蛋白，然後針對熒光強度，動態範圍，動力學和親和力這一系列指標進行最佳化篩選【4】。點飽和突變技術產生的突變蛋白適用於目標蛋白結構相近的情況，比如把與乙醯膽鹼結合的PBPs改造成能與尼古丁結合的PBPs【5】，但是因為血清素和乙醯膽鹼結構差異較大，沒有辦法將與它改造成能與血清素結合的PBPs。

隨著計算機技術的發展，計算生物學可以成功預測能與特定小分子進行選擇性結合的蛋白質結構並對蛋白質功能進行最佳化。2020年12月16日，來自加利福尼亞大學戴維斯分校的Lin Tian和Loren L. Looger研究組在Cell上發表題為Directed Evolution of a Selective and Sensitive Serotonin Sensor via Machine Learning的文章，作者首次將計算生物學應用到改進感測器的設計，並結合飽和突變技術產生的實驗資料進行機器學習分析，預測最優的突變體的結合點，反覆迭代設計，最終發現對19個點位進行突變，能成功將乙醯膽鹼感測器改造成血清素感測器。新的感測器（iSeroSnFR）對血清素的結合力提升了5000倍，同時不與原來敏感的膽鹼和乙醯膽鹼進行結合。

合成iSeroSnFR的流水線如下：

第一步，作者選擇一個來自於嗜熱嗜熱厭氧菌X513的對膽鹼結合的PBPs的變體iAChSnFR作為起始模板。選擇該模板的原因是因為其與血清素有可觀測的反應。作者再使用Rosetta套裝軟體【6】對預測該模板的變體與血清素的結合能力，並在250000種預測變體中挑選結合力最強的18個進行合成，純化，以及測試它們對血清素和其他小分子 (乙醯膽鹼, γ-氨基丁酸等等) 的熒光反應。測試後，作者再從18個變體中選擇對熒光反應最強的，而不與乙醯膽鹼反應的變體 (變體編號7，命名iSeroSnFR0.0) 再做最佳化。經過測試iSeroSnFR0.0對血清素的熒光反應對比iAChSnFR得到了18倍的提升。

第二步，作者使用隨機森林演算法對之前計算出的資料進行訓練，對iSeroSnFR0.0的各個位點對血清素結合力影響的重要性進行排序，選擇影響最大的4個位點使用點飽和突變技術，對其中的一個或者兩個位點進行改造，得到2576個變體。經過熒光測試後，發現其中100個變體對比iSeroSnFR0.0的熒光反應有2到3倍的提升。資料分析顯示實驗結果與隨機森林演算法幾乎吻合，值得注意的是單個突變對提高血清素的結合力效果有限，大幅度提高結合力需要多個突變。

第三步，因為突變的效果不是簡單疊加的，作者使用廣義線性模型演算法對實驗資料進行分析，瞭解單個突變點在不同情況下對整體效果的影響。廣義線性模型演算法在所有位置都預測出在幾種有益的氨基酸突變，選擇其中13種變體進行合成測試後，發現iSeroSnFR0.1變體對比iSeroSnFR0.0在熒光反應有8倍的提升，與血清素的親和力有2倍的提升。

之後對隨機森林預測的其他位點增加測試數量，產生新的實驗資料，以及結合作者之前設計感測器的實驗經驗，經過兩輪實驗，作者成功得到最優的變體iSeroSnFR。

隨後，作者對iSeroSnFR進行一系列測試和應用。首先作者將iSeroSnFR表達到哺乳動物(HEK293T) 細胞表面，也可以能透過神經膠蛋白將其表達到突觸後。兩種條件下，iSeroSnFR都能夠固定在細胞膜表面並對不同濃度的血清素有清晰的反應。特異性測試顯示iSeroSnFR對大部分小分子不發生反應，僅對色胺和多巴胺有反應。動力學測試顯示在10到40秒後傳感器熒光會達到飽和。經過實驗分析，熒光啟用有兩個不同相，慢相發生在初始期，熒光強度會快速升高 (特徵時間0.5-10 ms)，之後達到慢相，熒光會慢慢逐漸達到飽和 (特徵時間5-18s)。利用這個性質，可以讓感測器達到毫秒級的時間解析度。之後作者將這項技術應用在實驗中，能有效探測小鼠在恐懼狀態，社交活動，以及睡眠喚醒轉變中的血清素釋放。同時他們也發展了血清素轉運蛋白的臨床測定方法來用於研發藥物。

綜上所述，作者透過機器學習和點飽和突變技術相結合的方法，來指導血清素感測器的熒光蛋白設計，能大大減少搜尋空間，並大幅度提高感測器效能。更重要的是，設計其他感測器也可以借鑑這個思路。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.040

製版人：十一

參考文獻

1. Charnay, Yves, and Lucienne Léger. "Brain serotonergic circuitries." Dialogues in clinical neuroscience12.4 (2010): 471.

2. Broussard, Gerard J., et al. "Imaging Glutamate with Genetically Encoded Fluorescent Sensors." Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Humana Press, New York, NY, 2018. 117-153.

3. Marvin, Jonathan S., et al. "A genetically encoded, high‐signal‐to‐noise maltose sensor." Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 79.11 (2011): 3025-3036.

4. Packer, Michael S., and David R. Liu. "Methods for the directed evolution of proteins." Nature Reviews Genetics 16.7 (2015): 379-394.

5. Shivange, Amol V., et al. "Determining the pharmacokinetics of nicotinic drugs in the endoplasmic reticulum using biosensors." Journal of General Physiology 151.6 (2019): 738-757.

6. Bender, Brian J., et al. "Protocols for molecular modeling with Rosetta3 and RosettaScripts."Biochemistry 55.34 (2016): 4748-4763.