撰文 | Qi
責編 | 兮
對神經元型別“真相”的剖析對於理解複雜的神經元迴路功能至關重要，單細胞測序技術的發展已使得該領域研究成果呈現出爆發式增長。然而，將轉錄組資料給定的細胞型別與其他屬性，例如發育史、連線模式、電生理特性以及與行為相關的訊號編碼給定的細胞型別一致化仍具有挑戰性。近年來，這個問題已逐步開始得到解決，將scRNA-seq技術應用於細胞型別和功能已知的系統中能達成相對精準的對映，而不同神經元型別和腦區之間的神經元分子和功能特性的匹配程度卻大相徑庭。
哺乳動物的前額葉皮質（prefrontal cortex, PFC）在感知和行動轉化之間發揮關鍵作用，並作為獎賞導向的決策制定和行為靈活性等認知過程的基礎。雖然傳統的系統神經科學技術已經證明了複雜的任務相關訊號是如何在單個神經元和群體水平上編碼的，但這些研究通常忽略了細胞型別和投射模式。為此，最近一些小鼠實驗表明mPFC-NAc（nucleus accumbens，伏隔核）神經元在獎賞尋求的約束行為以及獎賞預測線索的表徵方面具有不同作用；此外，mPFC-PAG（periaqueductal gray，中腦導水管周圍灰質）神經元是多巴胺調節厭惡刺激編碼的關鍵節點。由於這些細胞群體中未知的分子異質性和行為任務的多樣性，匹配細胞型別和功能仍是一個持續的挑戰【1,2】。
2020年12月17日，來自美國斯坦福大學的駱利群課題組和Stephen R. Quake課題組在Cell雜誌上合作發表了一篇題為“Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classes across cognitive tasks”的文章，在這項研究中，作者研究特定轉錄型別的小鼠PFC神經元與軸突投射和編碼特性在多個認知任務中的關係，提出大多數神經元型別靶向多個靶點投射，且大多數靶點接受多種型別神經元的投射。此外，透過在自由活動的小鼠中進行“二選一”任務測試的鈣離子成像來評估這些神經元中存在的任務相關訊號的多樣性。
為了確定轉錄組型別並揭示PFC區域基因表達的潛在差異，作者對背內側區（dmPFC）、腹內側區（vmPFC）和眶額區（OFC）進行分析。首先，作者將Rbp4Cre與在Cre+細胞中表達tdTomato的報告小鼠雜交，雙轉基因後代從出生後第34天到第40天間分離組織，並使用SMART-Seq2對tdTomato+細胞進行熒光啟用細胞分類（FACS）和基於平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了來自三個區域的3139個細胞的。隨後，作者使用基於雜交鏈式反應的熒光原位雜交（hybridization chain reaction-based fluorescence in situ hybridization, HCR-FISH）檢查了PFC轉錄組型別之間標記表達的空間位置和共定位情況，發現dmPFC和vmPFC的轉錄組和空間組織相似，區分OFC的主要區別在於Pld5和Cxcr7（5-2）簇細胞的富集。需要注意的是，考慮到（1）vmPFC符合齧齒動物中基於丘腦內側的密集神經支配的PFC的傳統定義；以及（2）vmPFC中細胞型別的多樣性在給定空間中顯示出更緊湊的表現，使得追蹤和成像研究更加明確，因此在這項研究的剩餘部分作者僅關注vmPFC區域。
為了研究vmPFC投射神經元的轉錄組型別與特定靶點之間的關係，作者對小鼠注射逆行Cre表達病毒，透過解剖含有逆行標記tdTomato+細胞的vmPFC並執行scRNA-seq後發現，大多數投射定義的細胞群體由多種轉錄組組成，且每個轉錄組型別共同投射到多個目標。舉例而言，97%以上的vmPFC®PAG神經元對映到Npr3簇，雖然將這些群體稱為“PAG投射”，但要注意的是，PAG並非唯一靶點，即vmPFC®PAG神經元會將側支延伸到多個皮質下靶點。緊接著，作者對PAG或cPFC投射的tdTomato+神經元進行切片染色，以驗證上述部分觀察結果。結果顯示cPFC投射神經元與標記物Cd44、Cxcr7和Figf而不與Npr3共同標記，比例與測序資料中基本一致，與此相反，PAG投射神經元與Npr3而非Figf高頻率共同標記。因此，這部分研究分別透過轉錄組和投射訊號分析了不同的神經元群體。
接下來，作者試圖透過成像單個細胞水平的神經活動來探索不同的vmPFC細胞型別如何對決策制定的核心功能做出貢獻。為此，作者對自由活動的小鼠實施“二選一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任務（見圖1），小鼠被訓練在中心埠區分兩個氣味提示，透過移至正確埠獲取4μl水獎勵，反之錯誤的提示結果關聯則會導致短暫的吹氣處罰。作者透過光遺傳啟用皮層抑制神經元的使特定皮層區域沉默的有效策略測試vmPFC的神經活動對任務表現是否重要。作者在所有皮層GABA能抑制神經元中均表達ChR2的Gad2Cre；Ai32雙轉基因小鼠的vmPFC上方植入雙側光纖套管，結果顯示vmPFC對於2AFC任務的正確執行是必需的。
圖1，對行動自由的小鼠實施2AFC任務示意圖
那麼不同型別的vmPFC投射神經元如何編碼任務相關訊號呢？作者將上述試驗任務定義為四個階段分別是“Approach-Decision-Lick-Reward”，透過在Cre依賴的GCaMP6f小鼠中實施鈣離子成像以量化不同任務階段所有成像細胞的比例。結果顯示60%-80%的細胞都至少在一個階段活性增高，例如與cPFC投射神經元相比，PAG投射神經元和Rbp4Cre標記的類別在“Decision”階段活化的細胞比例更高；相反，與Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神經元在“Reward”階段活化的細胞比例較低。值得注意的是，許多vmPFC細胞不僅對任務階段表現出活動選擇性，而且對左或右的方向也有選擇性，而對於方向選擇性PAG投射神經元中包含大多數特定於選擇方向的資訊。
最後，作者在原有試驗的基礎上做出改動，小鼠需要辨別出四種可能氣味以正確獲取獎勵，隨後會切換到無氣味提示任務，這也是本研究的關鍵特徵，即對跨多個任務的行為編碼的探究。作者發現PAG投射神經元主要代表編碼氣味提示任務中的選擇性，但在切換到無提示任務時小鼠會花費數十秒迅速適應，而cPFC投射神經元則主要代表獎賞環境。這提示不同的細胞型別如何在不同的任務中發揮作用，並強調了在測試特定於細胞型別的編碼時具有多樣化的行為庫的重要性。
總的來說，這項工作透過scRNA-seq資料驅動對認知任務中編碼特性的分析，彌合了分子和系統神經科學間的重要鴻溝，進一步加深對PFC功能的理解，並推斷了任務資訊如何在細胞型別框架中組織的原理。
另外，兩支團隊於12月18日在Science雜誌上發表一項令人矚目的研究成果——“Cerebellar nuclei evolved by repeatedly duplicating a conserved cell-type set”。在這項工作中，作者以小腦的輸出結構“小腦核（cerebellar nuclei）”為模型系統，在細胞型別解析度水平上研究腦區進化。具體而言，作者透過對雞，小鼠和人類執行snRNA-seq，STARmap空間轉錄組分析以及全中樞神經系統投射追蹤，確定了一組包含兩個區域特異性興奮性神經元類別和三個區域恆定性抑制性神經元類別的保守細胞型別集合，而該集合能夠構成“亞核（subnucleus）”被反覆複製以形成新的區域。值得注意的是，在小鼠中負責優先將資訊收集並傳遞至外側額葉皮質（lateral frontal cortices）的興奮性神經元類別在大規模擴張的人類外側核（lateral nucleus）占主導地位，提示在複製原型亞核的框架內，進化會調整不同細胞型別的相對丰度。總而言之，這項研究展示出一個透過整個細胞型別集合的複製和分化而形成的大腦區域進化模型。
來自美國洛克菲勒大學發育神經生物學實驗室的Mary E. Hatten教授在同期雜誌上對這篇精彩文章作出評價，“傳統研究主要集中在小腦皮質，而忽略了小腦的輸出結構——小腦核。Kebschull等人利用先前發育研究中鑑定的標記物，為包含內側核，中間核和外側核在內的三個小腦核所有神經元提供分子概況，並透過展示小腦核神經元對大腦皮層廣泛區域的投射，擴充套件了我們對小腦核迴路的理解。”此外，Mary E. Hatten教授還表示，“這一研究也解決了進化過程中新腦區如何產生的關鍵問題。小腦核的數量從無顎魚類中的1個，增加到羊膜動物中的2個和哺乳動物中的3個，而在哺乳動物的三種小腦核中，內側核是最古老的，外側核是最年輕的。由於人類外側核神經元投射到認知區域，因此在外側核內選擇性地擴張B類興奮性神經元的發現尤其有趣。Kebschull等人對小腦核保守的進化模型的構建及其對小腦與皮質區域廣泛聯絡的探索為我們深入瞭解小腦回路的活動如何促進語言和高階認知過程打開了大門。”
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.046
https://doi.org/10.1126/science.abd5059
https://doi.org/10.1126/science.abf4483
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參考文獻
1, Murugan, M.,Jang, H.J., Park, M., Miller, E.M., Cox, J., Taliaferro, J.P., Parker, N.F.,Bhave, V., Hur, H., Liang, Y., et al. (2017). Combined Social and SpatialCoding in a Descending Projection from the Prefrontal Cortex. Cell 171,1663–1677.e1616.
2, VanderWeele, C.M., Siciliano, C.A., Matthews, G.A., Namburi, P., Izadmehr, E.M.,Espinel, I.C., Nieh, E.H., Schut, E.H.S., Padilla-Coreano, N., Burgos-Robles,A., et al. (2018). Dopamine enhances signal-to-noise ratio in corticalbrainstemencoding of aversive stimuli. Nature 563, 397–401.