【科研摘要】

有效的生產主機是將生物製藥和生物技術創新推向市場的關鍵要求。最近，《Small》上刊登了蘇黎世聯邦理工學院Steven Schmitt教授團隊的一篇文章High‐Throughput Optimization of Recombinant Protein Production in Microfluidic Gel Beads。該文描述了用於最佳化微生物蛋白質生產的真正通用的高通量平臺。使用液滴微流控技術，將菌株的大型遺傳文庫封裝到生物相容性凝膠珠中，這些凝膠珠經過工程設計以選擇性保留任何目標蛋白質。然後對保留的珠子產品進行熒游標記，並使用流式細胞儀分離出具有優異生產效價的菌株。透過成功培養幾種與工業相關的細菌和酵母菌株，並檢測透過自溶從細胞分泌或釋放的目標肽或蛋白質，證明了該平臺的廣泛適用性。最後，該平臺用於最佳化噬菌體（Komagatella phaffii，巴斯德畢赤酵母）中的角質酶分泌，並分離出具有5.7倍改進的菌株。該平臺每天可分析> 106個基因型，並且可輕鬆應用於可配備His6標籤的任何蛋白質。可以預見，該平臺將用於大型篩選活動，旨在識別用於大規模生產生物技術相關蛋白的改良宿主，從而加快菌株工程過程的成本和時間。

【文圖解析】

1.背景介紹

要實現生物製藥或生物技術分子的潛力，需要高效生產，這通常是使用專門設計的重組生產宿主來實現的。在這些微生物中，微生物具有很高的遺傳易加工性，可進行簡便的工程設計以提高產量，以及相對廉價和快速的發酵過程。這些多方面的好處使它們成為大規模異源生產各種生物產品（包括肽和蛋白質）的誘人選擇。特別地，使用芽孢桿菌屬和麴黴屬物種的微生物分泌在工業酶市場中佔絕對優勢。生物製藥領域中微生物宿主的存在也很重要，直到2018年市場上已批准的近400種生物製藥中，有105種是透過微生物生產的，目前還有更多候選藥物正在臨床開發中。

高效蛋白質生產的廣泛需求推動了多年來致力於最佳化微生物生產能力的研究工作。已成功用於提高蛋白質產量的菌株工程策略包括密碼子最佳化，轉錄和翻譯調節元件工程，細胞伴侶的共表達，增加溶解度增強標籤，蛋白酶的缺失，訊號肽工程以及分泌最佳化機械。然而，在實踐中，由於其對環境的高度依賴，對微生物生產進行合理的工程設計仍然很困難。產量不僅與直接參與產品合成或易位的細胞機制有關，而細胞機制本身很複雜，而且與宿主生物的更廣泛的生理密切相關，因此有必要針對個體量身定製最佳化策略蛋白質。此外，在許多情況下，理性工程完全失敗了。

2.1微流控膠珠中蛋白質的選擇性捕獲

該平臺依賴於在皮升體積的瓊脂糖凝膠珠（稱為皮升反應器（pLRs））中表達並釋放感興趣的His6標籤蛋白質的微生物菌株的遺傳多樣性種群的培養。生產後，目的蛋白被nickel‐nitriloacetic acid（Ni-NTA）功能化的捕獲微粒親和捕獲，然後被His6標籤特異性熒光探針標記。最後，使用常規的熒光啟用細胞分選儀分離出顯示最高熒光的pLR（圖1a）。在每種情況下都獲得了被包封的細胞向可見菌落的生長（圖1b）。為了評估單分散性和顆粒分佈，pLR裝有His6標籤的sfGFP，並透過流式細胞儀進行分析。熒光強度的窄分佈表明pLRs在大小和捕獲微粒分佈方面均是均勻的（圖1c），因此可以用作準相同的反應容器。

圖1平臺概述。

2.2 pLRs中蛋白質的熒游標記

作者選擇了相對不顯眼，簡短且常用的His6標籤，並努力開發一種可以將該標籤用於捕獲和標記的方法。意識到這兩個功能在不同的時間點是必需的，透過使用正交方法固定捕獲的蛋白質，可以釋放標籤以在稍後的工作流程中與染料相互作用。為了實現此標籤的雙功能性，作者使用了羧基和胺反應性分子3‐(ethyliminomethyleneamino)‐N,N‐dimethylpropan‐1‐amine（EDC）來共價交聯蛋白質，導致形成聚集體，這些聚集體透過pLR基質的孔。交聯後，透過新增EDTA，His6標籤從捕獲的微粒中釋放出來，從而釋放標籤，用於隨後引入靶向His6標籤的熒光染料（圖2a）。作者先使用載有His6標籤的sfGFP的pLR以1：1比例與不含蛋白質的pLR進行了驗證，驗證了該方案。用流式細胞儀定量熒光顯示，EDTA處理後保留了超過60％的最初結合的sfGFP（圖2b）。然後透過pLR封裝的交聯的His6標記的sfGFP的熒游標記證實了染料與pLR平臺的相容性（圖2c）。

圖2 pLR內部的蛋白質交聯和標記。

2.3檢測pLR中微生物產生的蛋白質

為了研究開發的pLR處理方案是否可以直接轉移到活細胞實驗中，作者透過兩個與工業相關的案例研究測試了方法：乳酸乳球菌分泌了一種乳酸鏈球菌素的前體素的His6標籤變體，乳酸鏈球菌素的前體具有在工業上用作食品防腐劑已有數十年的歷史，最近已被臨床評估為治療劑。嗜酸肺炎克雷伯菌分泌His6標記角質酶，一種混雜的真菌來源的α/β水解酶，已被建議用於多種在洗滌劑，製藥，紡織，生物燃料和生物修復行業中的應用。值得注意的是，模型蛋白不僅在功能方面而且在其理化特性方面都不同，第一個是7 kDa陽離子肽，第二個是22 kDa球狀蛋白。兩種菌株均被封裝到pLRs中並生長為微菌落。然後使pLR經歷交聯和標記方案。對於K.phaffii，添加了用SYTO9染色細胞生物質的附加步驟，而乳酸乳球菌共表達了紅色熒光蛋白mCherry。在這兩種情況下，與非分泌對照相比，流式細胞儀分析均顯示分泌菌株的Cy5熒光更高（圖3a）。作者利用蛋白質E介導的自溶作用將蛋白質從細胞釋放到pLR。使pLRs中的產生性細胞生長為微菌落，然後部分裂解（圖3b）。當生產細胞內帶有His6標籤的sfGFP的pLR封裝的自溶性大腸桿菌菌株經過pLR處理方案時，能夠在pLR內部檢測Cy5標記的His6標籤的sfGFP（圖3c）。

圖3 檢測pLR中微生物產生的肽和蛋白質。

2.4篩選增強的角質酶分泌

為了證該方法可用於分離表現出更高分泌滴度的菌株，作者使用了分泌角質酶K.phaffii細胞文庫。對其製備，透過用含有角質酶基因的線性化質粒轉化菌株來工程化野生型K. phaffii。質粒不能獨立地在細胞內繁殖，並且通常整合一次或極少數情況下整合入染色體，從而產生具有可變分泌滴度的轉化池。透過用紫外線照射細胞以將隨機突變整合到基因組中來進一步擴充套件遺傳多樣性，在某些情況下（例如由於細胞分泌途徑的改變）可能會進一步增加分泌能力。隨後，作者對該文庫進行了pLR篩選工作流程，並分析了總共9.6×105個含菌落的pLR，以分離出具有高Cy5/SYTO9熒光比（表明高產量）的反應器。總共254個具有高訊號比率的pLR被排列在板上（圖4a）。在這些中，有136個在平板上長成大菌落（54％），其中45個進行了第二次鑑定。上清液中角質酶活性的定量顯示9種菌株（20％）的分泌滴度超過了從文庫中隨機選擇的45個變體的分泌滴度。相對角質酶水平特別高的變體（X-33-CUT-B8）與模型菌株相比，分泌提高了5.1倍，並被選擇進行進一步表徵（圖4b）。

圖4.透過紫外線誘變的文庫篩選獲得的變體中分泌滴度的二級表徵。

參考文獻：

doi.org/10.1002/smll.202005523