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腫瘤是身體組織不正常增殖的表現形式，除了指甲和頭髮，它可以在人體的任何部位發生。每一種在研的抗腫瘤藥物都有明確的細分市場，尤其是進入靶向治療時代，絕大多藥物都要根據腫瘤的分子分型，如EGFR突變型、KRAS突變型和TP53失活型等，來分別開展臨床試驗。但是，即便針對同一種遺傳突變—如KRAS-G12C—的小分子抑制劑，在肺癌和腸癌上的效果也差異巨大。2017年5月，美國FDA根據包含149個病人的臨床試驗的結果批准了默沙東公司的PD-1抗體Keytruda用於治療攜帶dMMR/MSI-H（DNA錯配修復缺失/微衛星高度不穩定）的任何一種實體瘤。這是美國FDA史上第一次批准的不依據腫瘤器官來源，而是依據生物標誌物進行區分的抗腫瘤療法【1】。
PD-1抗體單藥在各種dMMR/MSI-H型實體瘤上產生了平均高達50%的客觀響應率，這是賦予其腫瘤治療“廣譜藥物”具有里程碑意義的事件。解析其療效的機制自然成為接下來最為重要的事情，它可以揭示腫瘤的致命軟肋，為開發更多廣譜高效的抗癌藥物提供借鑑。
2017年7月，第一篇報道其機制的文章就在Science上發表【2】，通訊作者正是前面臨床試驗的領導者，現為美國紀念斯隆-凱特林癌症中心的路易斯·迪亞茲（Luis Diaz)教授。本文中，作者首先發現dMMR/MSI-H型標誌物在其分析的24種腫瘤型別裡有發生，比例排名靠前的腫瘤包括子宮內膜癌（17%），胃腺癌（9%），腸癌（7%）等。DNA錯配修復系統是細胞裡負責糾正基因組複製過程中因為DNA聚合酶複製不保真導致的鹼基錯配的，所以缺失這個系統的腫瘤細胞平均會產生上千個突變負荷，進而生成大量的腫瘤neoantigen，這些neoantigen被認為是PD-1抗體所增強的抗腫瘤T細胞免疫應答的主要靶標。作者透過分析病人外周血中高頻擴增的T細胞克隆與其腫瘤細胞因為突變產生的neoantigen的對應性得到結論：DNA錯配修復系統缺失導致的大量neoantigen是此類腫瘤對免疫治療敏感的主要原因。
2017年11月，另一篇Nature文章【3】，作者構建了dMMR的小鼠腫瘤模型，並得到了與前文大致相似的資料，再次支援了dMMR介導的大量neoantigen是PD-1免疫治療高響應率的主要原因這個假說。但是，隨著更多的臨床試驗公佈結果，PD-1單藥對各種型別dMMR實體瘤裡的療效差異明顯（客觀相應率從30%-60%不等）。
為了研究dMMR腫瘤病人對免疫治療的不同響應率的機制，2019年5月，再有一篇Science文章【4】透過分析腫瘤細胞基因組上由於dMMR導致的微衛星不穩定以及突變型別與免疫治療響應情況的對應關係，發現微衛星不穩定水平越高或者具有更多移碼突變（產生更多的neoantigen）的腫瘤病人伴隨著更積極的免疫治療效果。本質上，這篇文章從另一個角度說明dMMR腫瘤的neoantigen對免疫治療的重要性，但侷限性是病人數量相對較少，需要更大規模的臨床資料來驗證。以上研究極大鼓舞了基於腫瘤突變負荷作為免疫治療標誌物的相關研究，
2020年6月，FDA批准了PD-1抗體Keytruda適用於任何突變負荷≥10 mut/Mb 的實體瘤治療【5】。至此，作為免疫治療標誌物的腫瘤突變負荷真要一錘定音？默沙東迎來賀電的同時，針對FDA的質疑也隨之而來。加州大學舊金山分校的腫瘤學家Vinay Prasad詳細列舉了12條原因對以上決定逐一批駁【6】。而來自哈佛大學丹娜-法伯癌症研究所的一個團隊在預印平臺BioRxiv上公佈的文章甚至直指FDA做出以上決定所參考的文獻有統計學錯誤【7】。孰對孰錯尚需時間沉澱，但回到dMMR腫瘤領域，從另外兩篇文獻可以得到一絲線索，雖然dMMR腫瘤以產生大量突變和伴有T細胞浸潤為主要特徵，但是相當多的dMMR腫瘤缺乏足夠的T細胞浸潤，而這些腫瘤含有高度不穩定的基因組微衛星以及高水平的突變負荷【8,9】。腫瘤組織的T細胞浸潤水平已被證明與PD-1抗體治療效果密切相關，目前臨床上仍然有50%上下的dMMR腫瘤病人不響應PD-1抗體的治療。在有大量突變負荷的情況下，dMMR腫瘤排斥T細胞浸潤是否是免疫治療不積極的原因，以及排斥T細胞浸潤的具體機制是什麼？
T細胞的有效啟用不僅依賴於抗原，還需要天然免疫識別所介導的共刺激分子訊號。胞質內的DNA識別，作為天然免疫識別的一個重要組成部分，在西南醫學中學的陳志堅實驗室獲得了突破性的發現和系統性的研究。著眼於此，2020年12月17日，西南醫學中心傅陽心教授和李國民教授合作在Cancer Cell雜誌上以背靠背的形式發表了兩篇文章。第一篇題目為“DNA Sensing in Mismatch Repair-deficient Tumor Cells Is Essential for Anti-tumor Immunity”的文章中，透過分析TCGA資料，作者發現腫瘤組織cGAS-STING通路基因的表達水平與dMMR腫瘤病人的預後呈顯著正相關，但卻沒有在pMMR（MMR-proficient）腫瘤中發現此現象。為了驗證這個現象，作者敲除MMR關鍵基因Mlh1，構建了dMMR小鼠腫瘤模型。他們發現，如果dMMR腫瘤細胞缺少Sting基因，免疫治療的效果就大打折扣。
因為PD-1抗體治療依賴於T細胞，他們進而分析了浸潤腫瘤的T細胞水平，發現在缺失Sting或者cGAS的dMMR腫瘤中T細胞顯著降低。為什麼降低呢？作者將腫瘤細胞和抗原遞呈細胞共培養，然後純化抗原遞呈細胞去刺激T細胞，發現dMMR腫瘤撫育過的抗原遞呈細胞相比對照組可以更強的促進T細胞增殖，而在dMMR腫瘤細胞裡敲除Sting後這種增強效應就消失了。
這個現象的機理又是什麼呢？I 型干擾素是cGAS-Sting通路識別DNA後的一個主要效應分子，而且它對T細胞的增殖有促進作用。所以，作者檢測了體外培養的dMMR細胞上清中的干擾素水平，結果顯示干擾素的蛋白水平在dMMR細胞組顯著上調，而敲除Sting或者cGAS後干擾素就恢復到本底水平。與干擾素結果相一致的是，dMMR腫瘤細胞有更多的胞質DNA，但當把MMR基因恢復回去，胞質DNA以及干擾素增加的現象就消失了。透過以上實驗，作者得到的結論是，MMR基因可以負調控腫瘤細胞的胞質DNA的產生，所以敲除了它會導致腫瘤細胞積累胞質DNA，進而啟用cGAS-Sting通路，產生干擾素。至此，作者發現了dMMR腫瘤產生大量neoantigen之外的新特徵。為了排除neoantigen而只評估這個新特徵對免疫治療的影響，作者構建了一種特殊的小鼠模型，在這個模型裡，T細胞只識別表達在dMMR腫瘤裡的一個固定neoantigen。結果發現，相比於具有同樣neoantigen的pMMR腫瘤，產生一型干擾素的dMMR腫瘤響應免疫治療更積極。
MMR系統負責修復DNA複製過程中的鹼基不匹配，理所當然, 缺失它會導致大量的突變負荷，但是為何會產生足以啟用cGAS的胞質DNA片段？為了探究MMR基因MLH1缺失啟用cGAS/STING通路的具體機制，在第二篇題目為“MLH1 Deficiency-Triggered DNA Hyper-Excision by Exonuclease 1 Activates the cGAS-STING Pathway”的文章中，作者發現MLH1可以調控Exo1的外切酶活性，進而維持染色體穩定性。缺失MLH1會導致Exo1的過度切割，產生更長的單鏈DNA，誘導RPA衰竭，並引起染色體異常，誘發新的雙鏈斷裂，從而釋放細胞質DNA，並激活cGAS產生更多的cGAMP。
為探究IR是否會增強MLH1缺失引起的cGAS通路啟用，作者首先檢測到IR照射後，dMLH1的細胞中積累了更多的細胞質DNA併產生了更多的cGAMP。同時作者發現，MLH1的缺失進一步增強了STING和STAT1的磷酸化水平，並且上調了ISG15和IRF7的表達，這些表型是依賴cGAS和STING的。
那麼MLH1誘導胞質DNA釋放並激活cGAS-STING通路的具體細胞機制是什麼呢？因為在DNA錯配修復和DNA雙鏈斷裂修復過程中， Exo1的外切酶活性是受到嚴格調控的，過度切割會產生很長的單鏈DNA。所以作者假設Exo1過度切割是MLH1缺失積累胞質DNA的誘因。為了驗證這個假設，作者在MLH1缺失的細胞中同時敲除Exo1，發現雙敲除的細胞中，細胞質DNA減少，磷酸化STING和磷酸化STAT1降低，同時ISG15和IRF7表達也下調，表明Exo1確實是調控cGAS-Sting通路的關鍵因子。
分子機制上作者發現MLH1可以透過相互作用調控Exo1在DNA錯配修復和DNA雙鏈斷裂修復中的活性，進而影響單鏈DNA的長度。透過laser的實時成像實驗，作者發現在MLH1缺失的細胞中，更多的Exo1會聚集在損傷位點，並持續更長的時間。而且在dMLH1細胞中，RPA會出現衰竭，進而導致染色體異常。該論文詳細地解釋了MLH1如何透過調控Exo1的活性來限制過度切割產生更多細胞質DNA的機制。
最後，再回到第一篇文章，這裡還有一個很重要的問題並沒有完全解決：為什麼50%的dMMR腫瘤病人對PD-1抗體治療不響應。因為在動物模型裡作者是人為敲除cGAS-Sting通路基因來實現治療耐受表型的，臨床上真的主要是cGAS-Sting通路的缺失導致的嗎？作者跟前面提到的美國紀念斯隆-凱特林癌症中心的路易斯·迪亞茲教授合作，拿到了一些dMMR腫瘤的RNA-seq資料，其病人都經過PD-1抗體治療。他們發現cGAS或者STING表達水平低的病人治療的效果明顯更差，那些不響應治療的病人的cGAS/STING水平明顯更低。為了在人類腫瘤裡進一步驗證小鼠dMMR腫瘤裡的基礎生物學發現，他們找到了一個自發的MMR基因缺失的人類結直腸癌細胞系HCT116，且這個細胞系的cGAS幾乎不表達。作者給這個細胞系恢復了cGAS的表達，然後把它接種到具有人的免疫系統的小鼠宿主上，發現cGAS恢復的腫瘤伴隨更多的人類T細胞浸潤，且響應免疫治療更積極。與此同時，作者發現在能得到的大概30個dMMR人類癌細胞系中，有60%的細胞系cGAS幾乎不表達。這個結果暗示cGAS在人類dMMR腫瘤的表達受損是廣泛存在的。為此，作者再次分析了TCGA資料庫，發現在子宮內膜癌和胃癌中，cGAS的表達水平在dMMR腫瘤裡比pMMR腫瘤顯著下降。
總的來說，該研究透過不同的維度（臨床-動物-細胞-蛋白-DNA）揭示了dMMR腫瘤的一個本質特徵，透過調控Exo1產生胞質DNA，這個特徵在一些腫瘤病人裡可以透過啟用腫瘤細胞的cGAS-STING通路對免疫治療產生積極影響；但在另外一些腫瘤裡，未知原因介導的cGAS-STING通路受損導致免疫治療效果不佳。所以，dMMR腫瘤細胞的neoantigen並不足以預測免疫治療的好壞，cGAS-STING通路的表達水平可以進一步作為dMMR腫瘤響應免疫治療的一個標誌物。
美國西南醫學中心的博士後盧長征（博士畢業於中科院生物物理所）和關俊宏（博士畢業於北京大學）為兩篇文章的共同第一作者，傅陽心教授和李國民教授為兩篇文章的共同通訊作者。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.11.006
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.11.004
參考文獻
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3. Germano, Giovanni, et al. "Inactivation of DNA repair triggers neoantigen generation and impairs tumour growth." Nature 552.7683 (2017): 116-120.
4. Mandal, Rajarsi, et al. "Genetic diversity of tumors with mismatch repair deficiency influences anti–PD-1 immunotherapy response." Science 364.6439 (2019): 485-491.
5. https://www.fda.gov/drugs/drug-approvals-and-databases/fda-approves-pembrolizumab-adults-and-children-tmb-h-solid-tumors
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