rAAV 載體中的核心啟動子

人體 的轉錄過程是依賴RNA 聚合酶II，其啟動子包括物核心啟動子和順式作用調控元件。

在人類中，順式作用調控域和核心啟動子常常含有CpG 島(c: g 比值 > 60% ，> 200bp)。

研究表明，在 rAAV 載體中 CpG 島的減少增加了轉基因表達，減少了 TLR9介導的免疫原性。

最小/核心啟動子需要一個轉錄起始位點(TSS) ，

這是一個用於轉錄因子(如 TATA結合蛋白或 TFIIB)的結合序列，指導 rna 聚合酶 II 的結合(如 ~ 35-bp 的上游定位 TATA/CAAT/GC-box 序列)。

許多基因具有不止一個 TSS，這些 TSS 在組織和不同發育階段具有不同的活性。

核心啟動子往往融合細胞特異性增強子和抑制片段。

強普適啟動子的核心啟動子(如核心 CMV [30bp ]、 SV40mini [106bp ]、 SCP3[81bp ])是常用的選項。

rAAV載體中的普適啟動子

在 rAAV 載體中使用的大多數啟動子是單向普適的啟動子，

如鉅細胞病毒早期增強子/鉅細胞病毒啟動子(CMV)、小CMV 啟動子(~ 300bp)、

鉅細胞病毒早期增強子/雞 β- 肌動蛋白啟動子(CBA aka CB7; 800bp)、

鉅細胞病毒早期增強子/雞 β- 肌動蛋白啟動子/β- 球蛋白內含子(CAG 或 CAGgs 或 CBA)、

人磷酸甘油酸激酶蛋白啟動子(PGK)

和延伸因子 -1α (ef-1α)。

CAG、 CMV 和 CBA 啟動子在視網膜中的總表達量超過 ef-1α 和 PGK 。

這些啟動子的衍生物在一些但不是所有組織中都具有一定的表達能力，

如 CMV/CBA-衍生物 CMV 早期增強子與嵌合雞 β-actin 啟動子(MVM)病毒衣殼蛋白(VP1)內含子(CBh; ~ 800bp)、

CBA-衍生 CMV 早期增強子與雞 β-actin 啟動子、

SV40晚期16S 內含子(CBA aka 7,800bp)

以及最小 CMV 內含子(260bp)。

然而，一些普適的啟動子在特定的細胞型別和組織中是沉默的。

例如，CMV 啟動子在海馬體、脊髓或黑質中表達時，與 CBh 啟動子相比，在10周以上時間內表達突然停止。

相反，CMV 啟動子在紋狀體中則沒有沉默。

鉅細胞病毒順式調節基因沉默在視網膜中的作用尚未得到證實。

注射 CMV.eGFP DNA 奈米粒兩天後在視網膜中表現出強大的表達，但兩週後未見表達。

在野生型和 CRB1相關的視網膜色素變性小鼠模型中，我們發現經過一到三個月的 rAAV 載體給藥後，感光細胞中有蛋白表達(GFP，CRB1，或 CRB2)。

在視網膜下注射 rAAV-CMVspCas9 兩週後，在小鼠視網膜扁平結構中檢測到 SpCas9。

類似地，rAAV-CMV-eGFP 載體轉導人 ipsc 衍生的視網膜類器官中兩到四周後，檢測到GFP的表達。

上述研究表明，普適的 CBA 和 CMV 啟動子很可能較少受到視網膜疾病狀態或細胞分化狀態的影響。

rAAV 載體中的雙順反子和三順反子啟動子

在基因治療載體中表達兩個或兩個以上的基因可以透過內部核糖體進入序列(IRES; non-read through linker)實現，否則則要使用兩個不同的啟動子。

啟動子可以透過一個融合蛋白連線子(如: (Gly4 Ser)2間隔子(約30bp; 通讀連線子)

或一個編碼自裂肽(T2A，P2A，E2A，F2A; 約30-75bp; 通讀連線子)

在基因序列之間驅動多基因的表達。

缺點是，融合蛋白可能改變一些蛋白質的功能，自裂肽則切割效率不確定。

此外，自裂肽總是在蛋白質產品上遺留額外的氨基酸。

一個啟動子的驅動若干基因，通常會降低每個後續基因的表達。

然而，研究人員證明了單個啟動子驅動三個基因(如 Oct4、 Sox2和 Klf4)在神經節細胞表達的可行性，載體是rAAV9，三個基因表達透過自裂肽序列相連線。

rAAV9-Oct4/Sox2/Klf4表達載體挽救了視神經損傷小鼠模型的神經節細胞存活。

在 IRES (572bp)或最小 IRES (436bp)允許兩個間隔的獨立基因有效表達。

然而，研究表明，與使用常規啟動子相比，IRES 後面的蛋白質產量減少。

在順反子間序列中加入一個間隔基(約30-90bp)可以促進第二基因依賴於 ires 的翻譯。

有許多不同的 IRES 是從不同的病毒中提取出來的，例如在微小病毒科。

將兩個啟動子背靠背放在一起，也可以實現一個載體同時表達兩個基因。

視網膜特異性啟動子

使用天然序列可能會精確調節轉錄，從而防止過度表達。

因此，一個天然的啟動子可以減少由於轉基因過度表達而產生的毒性。

已經開發了許多視網膜細胞型別特異性啟動子。

組織特異性啟動子的選擇和驗證是複雜和耗時的。

在小鼠中許多組織特異性啟動子在人類或非人類靈長類動物中被證明是不那麼特異的。

此外，與 CBA/CMV/CAG 泛啟動子相比，許多組織特異性啟動子驅動的基因表達水平要低得多。

許多組織特異性啟動子可以有效地表達 rAAV- 基因盒中的許多轉基因。

cDNA 密碼子最佳化、內含子(如 MVM、 SV40)和增強子(如 CMVe、 IRBPe、 Grm6e)可以顯著提高組織特異性啟動子的活性。

當一個細胞中的轉錄因子池發生變化時，就很難預測細胞特異性啟動子在疾病狀態下的表現。

許多病毒啟動子的進化使病毒在不同的細胞環境中生存最大化。

一些病毒啟動子在不同的細胞“狀態”(應激、發展期、細胞週期)都能表達。

例如，廣泛使用的 CMV 或 SV40早期啟動子。

向細胞特異性啟動子中新增 CMV 即時早期增強子(CMVe 或 CE)通常會增加表達，但也可能降低特異性。

不幸的是，許多組織特異性啟動子太大，無法適合 rAAV 載體。

擬合取決於目的基因的大小，這就是為什麼許多啟動子進一步縮短，以最佳化細胞型別特異性表達。

核小RNA (snRNA)啟動子

依賴RNA 聚合酶(RNAP)的啟動子(U1，U2，U6，U7，H1; ~ 250bp)可以驅動短髮夾 RNA (shRNAs)轉錄。

人 U6啟動子是一個強有力的啟動子，廣泛用於 shRNAs 的表達。

然而，相對較大的體積、轉錄基因必須以 g 或 a 開頭、有時過於活躍的轉錄以及對特定細胞的敏感性，使得U6啟動子不那麼靈活。

RNA 聚合酶 III相關啟動子或與 CMV 增強子或與組織特異性增強子(心臟，肌肉)聯用，驅動 siRNA 的表達。

組織特異性增強子增加了表達量但卻降低了組織特異性。

在 rAAV 基因盒中，sgRNA (Single guide RNAs，gRNA)通常由 U3或 U6 RNA 啟動子表達。

獲得兩個用於 CRISPR/Cas 基因編輯的 gRNAs 在肌管中的相對組織特異性表達。

對於核小RNA 啟動子的組織特異性表達的研究是一個未被充分代表的領域。

WPRE，內含子，mirna 和 raav- 基因盒中的其他元素

轉錄後調控元件(PRE)可以大幅度增加基因表達。

土撥鼠轉錄後調控元件(WPRE; 600 bp)或乙型肝炎病毒轉錄後調控元件(HPRE; 533 bp)可使轉基因表達增加6-9倍。

此外，WPRE 還可以防止人類胚胎幹細胞和大腦的沉默。

一個較短版本的 WPRE (wpre3; 247 bp)顯示在海馬神經元培養中僅有15% 的表達下降，

或者在 rAAV 感染小鼠大腦海馬 CA1區的 GFP 表達下降。

如果與包含內含子的啟動子結合使用，WPRE 可能是冗餘的。

當加入 CAG 或 ef-1α 時，沒有發現轉基因表達的增加。

許多內含子已經為 rAAV 基因盒開發，可以提高基因表達。

特別是病毒衣殼蛋白(VP-1)的強 MVM 內含子 -1(67ー97 bp)可使轉錄表達增加10 × 。

在眼部基因治療中，可以選擇性地加入微小 miRNA，~ 18-25bp 以防止轉基因的異位表達。

在 rAAV2/5中加入 miRNA204的4 × 互補序列。

CMV.eGFP.WPRE. 4 xmiRNA204T 能顯著降低視網膜下注射後 RPE 細胞 eGFP 的表達。

同樣，加入4 × miR-124的互補序列，可以去除光感受器中的表達。

然而，當使用 miRNA 時，需要考慮同源 miRNA 的過飽和，因為它們會降低細胞中天然 miRNA 的功能。

rAAV- 基因盒中的多聚腺苷酸序列

為了有效地進行前 mRNA 處理，需要在轉基因後加入一個有效的多聚腺苷酸序列，以便在 RNA 的3′端形成一個合適的多聚腺苷酸(poly (a) tail)。

rAAVs 基因盒中的多聚腺苷酸化序列，包括

SV40 polyA (135bp; + + +)、

bGH polyA (250bp; + +)、

2 × SV40 polyA (上游元件(100bp，+ +)

2 × sNRP1 (34bp，+/+) ，

人工合成的 polyA (spA; 49-60bp，+) ，

hGH polyA (624bp，+) ，

1 × sNRP1 polyA (17bp，+) ，

腺病毒 L3 polyA (21bp，+)。

SV40 polyA訊號上游元件和 SV40 polyA訊號與 wpre3(420bp)結合後，

其長度比常用的 wpre-bGH polya 基因盒(919bp)縮短了一半以上，但保持相似的表達譜。

聚腺苷酸序列與轉錄調控促進劑的相互作用可以提高轉錄水平。

然而，這種影響可以是相當具體的事件。

例如，將 cmvβ 增強子與 SV40 polyA 配對增加了轉錄水平，

但是與 bGH polyA 配對卻沒有。

誘導型啟動子

許多基因補充療法依賴於治療基因的不斷過度表達。

恆定的活性表達增加了載體本身對細胞產生毒性的風險。

應激(GFAP 啟動子)或缺氧驅動的 GFAP 啟動子(hrse-6xhre-GFAP 1d)已經產生，

對於連續過表達的人工基因載體敏感的細胞可能更安全。

其它誘導型基因表達系統包括:

四環素(Ptet)、

二氫葉酸還原酶(DHFR)蛋白不穩定結構域、

核開關、金屬啟用啟動子(metallothionine-Ia; MT-1)

和激素啟用啟動子(hormone-activated protesters，MMTV LTR)。

Tet- 系統是由一種抗生素(四環素或強力黴素)啟用的，

其對人類使用不是最理想的。

有效的 TET-off rAAV 系統的一個例子是 rAAV 表達盒，

其中包括放置在最小啟動子(CMV; ~ 40bp; 總順反子大小: ~ 270bp)前的6x 突變四環素反應元件(TRE; ~ 200bp)。

當 rAAV 感染細胞後，普適啟動子 UbC 將驅動反式啟用劑：反向四環素轉運因子3(rtTA3) ，

使其成為 Tet-on 系統。

在 Cre 重組酶表達後，rtTA3被切除，將表達載體轉化為 Tet-off 系統。

核糖開關（Riboswitches）因其體積小(順式作用 RNA 序列100bp)、對配體的適應性以及合成核糖開關的發展而引起人們的廣泛關注。

核糖開關編碼一個配體感應適配體，一個通訊模組(聯結器)和一個效應域(核酶) ，

若配體存在，則切斷基因表達的mRNA。

通過了概念驗證研究，證明了核糖開關在眼部基因治療中的可行性。